[发明专利]烟草花叶病毒衣壳蛋白半胱氨酸突变体及其应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及烟草花叶病毒衣壳蛋白半胱氨酸突变体、编码基因以及化学修饰的烟草花叶病毒衣壳蛋白半胱氨酸突变体，及其应用。

（二）背景技术

病毒作为一种感染力极强的生物体系而被人类熟知，绝大部分病毒是由病毒衣壳蛋白和它内含的核酸构成。病毒的外壳是由复数个蛋白质单体通过自组装方式聚集起来的，因此可以通过基因工程对其衣壳蛋白质的表面及其内部的氨基酸序列进行任意裁剪与设计。近年来的研究表明，病毒可以作为一种新型的生物纳米材料而被人类利用。

烟草花叶病毒（TMV）是一种对农业生产有极大危害的植物病毒病原体，是植物病毒中研究的最为详细的一种，在形态、粒体结构、化学组成、组装、外壳、亚基组成、基因组结构、核酸复制、蛋白翻译、病毒在细胞间的运动等方面常作为病毒学研究的经典范例。TMV是一种感染烟草的植物RNA病毒。成熟的TMV由一条单链RNA及包围在外部的约2130个相同的衣壳蛋白单体构成，每个蛋白单体由159个氨基酸组成。该病毒呈有规则的筒状，直径约为18nm，长度约为300nm，内部有一个约直径4nm的中孔。TMV受周围溶液的pH及Ca²⁺浓度的影响，存在蛋白单体与完整的病毒筒状结构的平衡。感染TMV后，因为细胞内高pH值及低Ca²⁺浓度环境，病毒的衣壳蛋白发生解离，从而释放内部的RNA进行复制及蛋白质的翻译。在细胞外低pH及高Ca²⁺浓度环境时，衣壳蛋白发生自组装而形成完整的病毒粒子。已有研究发现，病毒RNA的缺损并不影响衣壳蛋白自身的组装。

基于TMV的这些特征，本发明旨在构建TMV衣壳蛋白及其半胱氨酸的突变体在大肠杆菌中表达的质粒，把该质粒转化到大肠杆菌中表达TMV野生型及变异型衣壳蛋白单体，并确立纯化该类蛋白单体的方法，进一步通过芘分子对TMV衣壳蛋白的内孔进行化学修饰，以评估该种修饰是否会影响病毒衣壳蛋白的自组装，为TMV作为纳米药物载体的开发提供理论依据。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种烟草花叶病毒衣壳蛋白半胱氨酸突变体以及化学修饰的烟草花叶病毒衣壳蛋白半胱氨酸突变体，及其在制备纳米药物载体中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种烟草花叶病毒衣壳蛋白半胱氨酸突变体，由SEQ ID No.1所示氨基酸序列经点突变得到，所述点突变为：第27位突变为丙氨酸，和第98～101位之一突变为半胱氨酸。该突变体由野生型烟草花叶病毒衣壳蛋白的C27位点突变为A，和N98、Q99、A100、N101位点之一突变为C得到。

SEQ ID No.1序列如下：

SYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCTNALGNQFQTQQARTVVQR QFSEVWKPSPQVTVRFPDSDFKVYRYNAVLDPLVTALLGAFDTRNRIIE VENQANPTTAETLDATRRVDDATVAIRSAINNLIVELIRGTGSYNRSSFE SSSGLVWTSGPAT（下划线为突变位点）

该野生型TMV蛋白单体的cDNA全基因序列如下（SEQ ID No.2）：

TCTTACTCGATTACCACTCCATCCCAGTTCGTTTTCCTGTCCTCT GCTTGGGCAGACCCGATCGAACTGATCAACCTGGCTACTAACGCAC TGGGTAACCAGTTTCAGACTCAGCAGGCTCGTACTGTAGTTCAGCG TAAATTCTCTGAAGTTTGGAAACCGTCTCCTCAGGTAACTGTTCGTT TCCCGGACTCTGACTTCAAAGTATACCGTTACAACGCTGTACTGGAC CCGCTGGTTACCGCTCTGCTGGGCGCTTTCGACACTCGTAACCGTAT CATCGAAGTAGAAAACCAGGCAAACCCGACCACCGCGGAAACTCT GGACGCAACCCGTCGTGTTGACGACGCTACCGTTGCAATCCGTTCC GCTATCAACAACCTGATCGTTGAACTGATTCGTGGTACCGGTTCCTA CAACCGCTCTTCTTTCGAATCTTCCTCCGGTCTGGTATGGACCTCGG GCCCGGCAACT。

具体的，四种突变体的氨基酸序列如下：