[发明专利]一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基

权利要求书

1.一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子，其特征在于，该细胞因子是由以下制备方法得到的，其包括如下步骤:

（1）从胎龄为11天的胚胎小鼠中分离出胎肝基质细胞,然后用SV40大T抗原转化这些原代基质细胞；

（2）经步骤（1）转染后的细胞筛选出对脐带血造血干细胞有扩增作用的永生化细胞;

(3)将（2）步筛选出的胎肝细胞连续传代，得到细胞系，进一步检测该细胞系对脐带血造血干细胞的扩增作用及对维持干细胞特性的作用；

（4）经（3）步验证后，提取（3）步中筛选出来能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞与不能支持脐带血造血干细胞体外增殖的细胞3T3的总RNA；

(5)将(4)中提取的能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞与不能支持脐带血造血干细胞体外增殖的细胞3T3的总RNA反转录成cDNA；

（6）将（5）得到的cDNA做基因芯片分析;

(7)将（6）步得到的结果分析比较能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞与不能支持脐带血造血干细胞体外增殖细胞3T3的表达图谱，发现5’-TAACCCTGAGGTCACTTAACCCATTTTCCCTAACTGAGGCTTAGATGACACGAGGGAAAA-3’的序列在能刺激脐带血造血干细胞体外增殖的小鼠胎肝细胞中高表达；

（8）将（7）的核苷酸序列在美国国立生物信息中心数据库中搜索出该片段位于ANGPTL7基因内；

（9）将（8）筛选到基因的cDNA连同一段编码六个组氨酸的核苷酸序列5’-CACCATCATCATCATCAT-3’克隆到能够把目的基因导入到基因组中的PB载体中，然后通过脂质体转染的方法将该载体与另一个含有编码PB酶的辅助载体一起转染293T细胞得到能够过表达目的基因的293T细胞;

(10)将(9)构建好的能表达目的蛋白的293T细胞扩大培养,利用镍离子亲和纯化的方法纯化出目的蛋白；

(11)将(10)纯化的蛋白添加到含有SCF,TPO,FLT3L,PTN的StemSpan培养基中，再利用这个含有目的蛋白的培养基培养脐带血造血干细胞验证ANGPTL7能促进脐带血造血干细胞的体外增殖。

2.根据权利要求1所述的扩增脐带血造血干细胞的细胞因子，其特征在于，所述步骤（3）中将（2）步筛选出的胎肝细胞培养增殖所使用的培养基为含有质量浓度分别为10%血清、1%双抗的α-MEM培养基。

3.一种含有权利要求1所述细胞因子的培养基，其特征在于，该培养基为StemSpan培养基，该培养基包括50-100ng/ml的SCF,20-50ng/mlTPO,50-100ng/ml FLT3L,50-100ng/ml PTN。

4.根据权利要求3所述细胞因子的培养基，其特征在于，在StemSpan培养基中还包括200ng/ml-2ug/ml的ANGPTL7蛋白。