[发明专利]单核增生李斯特氏菌富集和快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体采用双功能纳米金磁微粒集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析快速检测单核增生李斯特氏菌。

技术背景

单核细胞增生李斯特氏菌简称单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LM)，是李斯特菌属中最重要的人类食源性病原菌。肉、蛋、海产品、乳制品、蔬菜等食品均是LM的主要污染源，人被LM感染后死亡率可达30%，在新生婴幼儿和免疫力低下的人群中死亡率则高达70%。该菌在4℃冰箱保存的食物中仍能生长繁殖，使其成为冷藏食品中主要的病原菌之一。按照我国国标法规定的检测方法，完成LM初筛过程需72~96h。如此长的检测周期给企业、国家相关部门对日常产品质量监测及LM中毒事件进行快速反馈带来了一定困难。

    免疫学检测是实现LM快速筛查的有效手段之一。比较经典的流程包括前期增菌、免疫磁珠高效富集及胶体金免疫层析试纸条或ELISA检测等步骤。其中提高免疫磁珠富集效率对缩短LM检出时间具有较大的贡献。免疫磁分离是基于抗原、抗体免疫学反应，利用超顺磁粒子在磁场存在时能迅速磁化并聚集、磁场消失后可重新分散于溶液的特性的一种磁分离方法。一些研究把免疫磁捕获和实时荧光PCR技术结合起来，检测食品中的单核增生李斯特菌。PCR方法和生物传感器方法都具有较高的检测灵敏度，一般可将检测时间减少至24-48小时（依据不同检测项目而言），但是该方法要求具有较高素质的操作人员、较好的检测仪器以及检测条件，因此较难在基层以及企业大面积推广使用，同时检测时间仍很难满足企业对出厂前产品质量安全进行快速反应的实际需求，且该方法无法分辨死/活致病菌以及DNA片段的同源性，易造成假阳性偏高的结果；而在检测很多食品基质时，又会因为一些物质的存在而抑制了DNA聚合酶的活性，从而造成假阴性。免疫学尤其是免疫层析方法，不需复杂仪器设备，检测时间快（一般15 min即可获得结果），易操作，但目前该类方法总体检测灵敏度偏低(需要细菌浓度需达到10^5-6 CFU/mL)，因此针对食品样品检测，往往需要较长的增菌时间。目前单核增生李斯特菌免疫学方法，采用胶体金免疫层析技术检测，从增菌到检测需要至少24小时才能实现25 g样品中单菌的检测。

由于微生物的生长具有其特定的生理周期，通过优化培养条件缩短时间效果不明显；因此多采用免疫磁珠分离技术富集。依赖于特异性抗体的免疫磁珠分离技术可有效地提高待测微生物的检测灵敏度，已逐渐成为食源性致病菌特异性分离和浓缩的最有效手段之一，并广泛应用于单核增生李斯特菌等食源性致病菌的富集，大大缩短了食源性致病菌整体检测时间。

以膜为固相载体的胶体金免疫层析法是20世纪80年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型检测方法。由于其快速、便捷、不需特殊设备、结果判断直观、可以现场进行检测的特点，近年来越来越受到人们的重视，其技术发展迅速，在的检测领域得到了广泛应用。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，标记物的颜色很淡几乎用肉眼难以判断结果，虽然目前市场上有针对胶体金等标记的免疫层析试纸条判读的仪器，但是这种仪器仅能对在固相载体表面的标记物颜色检测，而对固相载体内部的标记物很难检测到，因此检测的灵敏度受到很大限制。同时检测的生物样本中可能含有颜色物质会严重影响检测的结果和灵敏度。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、灵敏、简便的单核增生李斯特氏菌定性、定量检测技术。

本发明具体方案如下：