[发明专利]大肠杆菌O157：H7富集和快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体采用双功能纳米金磁微粒集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析快速检测大肠杆菌O157：H7。

技术背景

微生物引起的食源性疾病是全世界、也是我国的头号食品安全问题。在食源性致病菌中，大肠杆菌O157:H7是最危险的一个，它的感染剂量非常低，最低10个活菌就可能感染致病。大肠杆菌O157:H7感染后一般先出现腹部绞痛和非出血性腹泻，超过70%的病人能够发展成出血性腹泻，30%～60%的病例有呕吐现象，30%的病例有低度发热症状。3%-5%的病人能够发展成溶血性尿毒综合症导致急性肾衰竭而死亡。能够污染猪肉、禽肉、牛肉、牛奶、果汁、冷三明治、蔬菜和饮水等，该菌的流行暴发大多是因为食用了被该菌污染的食物或未严格消毒的饮用水。此外，还能通过人与人之间的接触传播。

目前，检测大肠杆菌O157：H7的方法有传统分离鉴定法、PCR方法、生物传感器方法、免疫学方法等。对于传统分离鉴定法检测大肠杆菌，费时耗力（5－7天），需要专业人员操作，因此该方法只能用于执法部门对中毒事件的起因进行分析，以及对市场食品安全状况进行评估，而无法满足现代化企业对出厂前产品的质量安全做出快速有效评价及急性中毒事件原因的确认。PCR方法和生物传感器方法都具有较高的检测灵敏度，一般可将检测时间减少至24-48小时（依据不同检测项目而言），但是该方法要求具有较高素质的操作人员、较好的检测仪器以及检测条件，因此较难在基层以及企业大面积推广使用，同时检测时间仍很难满足企业对出厂前产品质量安全进行快速反应的实际需求，且该方法无法分辨死/活致病菌以及DNA片段的同源性，易造成假阳性偏高的结果；而在检测很多食品基质时，又会因为一些物质的存在而抑制了DNA聚合酶的活性，从而造成假阴性。免疫学尤其是免疫层析方法，不需复杂仪器设备，检测时间快（一般15 min即可获得结果），易操作，但目前该类方法总体检测灵敏度偏低(需要细菌浓度需达到10⁵-10⁶ CFU/mL)，因此针对食品样品检测，往往需要较长的增菌时间。目前大肠杆菌O157:H7免疫学方法，采用胶体金免疫层析技术检测，从增菌到检测需要至少24小时才能实现25 g样品中单菌的检测。

由于微生物的生长具有其特定的生理周期，通过优化培养条件缩短时间效果不明显；因此多采用免疫磁珠分离技术富集。依赖于特异性抗体的免疫磁珠分离技术可有效地提高待测微生物的检测灵敏度，已逐渐成为食源性致病菌特异性分离和浓缩的最有效手段之一，并广泛应用于大肠杆菌O157：H7等食源性致病菌的富集，大大缩短了食源性致病菌整体检测时间。

以膜为固相载体的胶体金免疫层析法是20世纪80年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型检测方法。由于其快速、便捷、不需特殊设备、结果判断直观、可以现场进行检测的特点，近年来越来越受到人们的重视，其技术发展迅速，在的检测领域得到了广泛应用。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，标记物的颜色很淡几乎用肉眼难以判断结果，虽然目前市场上有针对胶体金等标记的免疫层析试纸条判读的仪器，但是这种仪器仅能对在固相载体表面的标记物颜色检测，而对固相载体内部的标记物很难检测到，因此检测的灵敏度受到很大限制。同时检测的生物样本中可能含有颜色物质会严重影响检测的结果和灵敏度。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、灵敏、简便的大肠杆菌O157：H7定性、定量检测技术。

本发明具体方案如下：