[发明专利]一种青花菜的组织培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种促进青花菜顽固基因型小孢子胚胎发生的组织培养方法。

背景技术

青花菜(Brassica oleracea L.var.italica)又名西兰花、绿菜花、茎椰菜等，是十字花科芸薹属甘蓝种中以绿色花球为产品器官的一、二生草本植物，其以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为产品，营养丰富，色、香、味具佳，是国际市场十分畅销的一种名特蔬菜。目前，我国青花菜主栽品种大部分都来自国外，具有我们自主知识产权的品种匮乏，究其原因是因为国内青花菜优异育种资源很少，配制不出好的材料，因此迫切需要通过育种的手段，把市场上应用的品种进行多年自交分离。传统的多代自交分离的方法一般需要5～6年的时间才能选育到一个纯合的亲本材料。而小孢子培养方法可以在1～2年内快速获得双单倍体纯系，比传统的方法缩短了3～4年的时间，从而大大缩短了育种进程，提高了育种的效率。

自1982年Lichter首次报道油菜游离小孢子培养获得再生植株以来，芸薹属作物的小孢子培养，无论是在出胚率、出胚量及再生植株方面都获得了较大成功。相对于甘蓝型油菜来说，青花菜游离小孢子的培养难度较大。国外研究最早见于1991年Takahata等人的报道，国内则是张德双等1997年在青花菜品种“巴绿”的研究上获得成功。随后，张延国等（中国蔬菜，2005（6）：7～9）、方淑桂等（福建农林大学学报（自然科学版），2005,34（1）：51～55）、袁素霞（中国农业科学，2009,42（1）：189～197）等人也有报道，但存在问题是小孢子胚胎发生率普遍不高，且受基因型影响较大。申请号为200910101722.5的中国发明专利申请中公开了一种青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，主要涉及改变常规培养基成分和培养方法，以提高青花菜植株的二倍体率。专利号为ZL201110112536.9的中国发明专利主要是采用青花菜顽固基因型小孢子与易出胚油菜的小孢子共培养的方法，达到了促进青花菜小孢子出胚的目的，但由于是小孢子共同培养，对于得到的胚状体可能是青花菜胚状体，也可能是油菜胚状体，要到田间种植后才能判断，选育时间较长。

发明内容

本发明提供了一种青花菜的组织培养方法，采用青花菜顽固基因型游离小孢子与小麦子房按一定数目配比共培养，显著促进了青花菜小孢子胚胎发生，操作方便。

一种青花菜的组织培养方法，包括以下步骤：

（1）取青花菜的花蕾和小麦子房，灭菌；

（2）将灭菌后的花蕾配制成小孢子悬浮液，将所述小孢子悬浮液和小麦子房置于培养液中混合培养，诱导获得子叶型胚状体；

（3）将子叶型胚状体接入分化培养基中，培养获得再生植株；

（4）从再生植株切取再生芽，接入生根培养基，获得完整植株。

本发明中的培养方法为小麦子房与青花菜小孢子混合培养，利用小麦子房的良好刺激作用，促进青花菜小孢子胚胎发生。另外，培养过程中，青花菜的小孢子胚胎发生、发育过程都能与小麦子房显著区分，培养得到的胚状体在初期即可确定为青花菜的胚状体，且方法简便易行，易于操作。

步骤（1）中灭菌时所用灭菌液成分为次氯酸钠56mL/L+99%酒精100mL/L+洗涤精200μL。

作为优选，所述花蕾与小麦子房的数量比为1：5～10。

进一步优选，所述青花菜的花蕾为处于单核晚期的青花菜花蕾；所述小麦子房取自受精前2～3天的小麦麦穗。

更进一步优选，所述青花菜花蕾的花瓣和花药长度比为0.8～1.2：1；花蕾灭菌后置于无菌NLN-13液体培养基中预培养1～3天。

作为优选，步骤（2）中，将所述花蕾用所述培养液配制成小孢子悬浮液，将小孢子悬浮液与所述小麦子房混合培养。

所述培养液为NLN-13液体培养基和无菌活性炭混合液的混合物。

所述活性炭混合液的组成为：1L NLN液体培养基、2～5g琼脂糖和1g活性炭。

所述培养液中活性炭混合液与NLN-13液体培养基的体积比为1:80。

配制成小孢子悬浮液的过程为：

向灭菌后的青花菜花蕾中加入NLN-13液体培养基研磨成悬浮液，将所述悬浮液经过滤、离心、去上清后得沉淀，依次加入NLN-13液体培养基和无菌活性炭混合液（即上述培养液）混配成小孢子悬浮液。

所述过滤、离心、去上清得沉淀过程进行1～2次，所述过滤采用300目无菌滤网，所述离心为700～1000rpm离心3～5分钟。