[发明专利]一种无动物源性和人源性成分T淋巴细胞培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种用于培养人类T淋巴细胞的培养基配方及其制备方法。 

背景技术

T细胞是淋巴细胞的主要组分之一，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助其它淋巴细胞发挥功能，对特异性抗原或促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体抵御疾病感染、防止肿瘤形成的主要免疫细胞之一。在体外富集、活化、扩增这类免疫细胞，可用于回输治疗多种疾病，包括恶性肿瘤、感染、自身免疫病等，在这个过程中，需要用到一种可以在体外支持T细胞存活和扩增的培养基。 

T细胞在体外存活和扩增需要的营养物质包括：氨基酸、维生素、糖、脂质、无机盐、生长因子等。传统的培养基为了提供这些营养因子，大多采用动物或人的血清作为添加物，比较常见的有新生牛血清、胎牛血清、人AB血清等。使用牛血清的优点是有足够的量供应，价格便宜，但是使用牛血清的缺点是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，而且牛血清并不能很好的支持人T淋巴细胞的生长(Imir，P等，Clin.Immunol.Immunopath.，36：289-296(1985))。使用人AB血清的可以很好的支持人T淋巴细胞的生长，但是人AB血清来源困难，供应量有限，而且也存在传播疾病的风险。因此，以临床应用为目的T淋巴细胞培养基中应尽量避免使用动物来源和人体来源的原料。 

戴育成(申请公布号：CN102191215A)发明了一种用于培养CIK细胞的人源性无血清培养基，培养基中含有多种人血来源的成分，包括人白蛋白、人转铁蛋白、人胆固醇、人过氧化氢酶等，证实可以培养和诱导CIK细胞，优于有血清培养基。任秀宝(授权公告号：CN1261562C)发明了一种用于培养淋巴细胞的无血清培养基，培养基中含有动物来源或人体来源的转铁蛋白，证实培养基的培养效果与含2％人血清的培养基相当。Invitrogen公司生产的用于体外淋巴细胞培养的培养基AIM-V也含有人体来源的人血白蛋白和人转铁蛋白。Invitrogen公司的另一款用于体外培养T淋巴细胞的培养基Optmizer也只是不含有动物来源的成分，但还是含有人体来源的人血白蛋白和人转铁蛋白。这些培养基中都或多或少地添加了动物来源或人血来源的成分，虽然有严格的检测和病毒灭活的处理，但是还是存在一定的安全性隐患。 

综上所述，作为治疗用的T淋巴细胞的培养基，应该有以下几个特点：安全、稳定、廉价等。本发明着力于解决上述问题，提供了一种更加安全，质量更稳定且成本低廉的T淋巴细胞培养基，而且其培养人T淋巴细胞的效果与含人血清的培养基相当，部分指标优于含人血清培养基。 

发明内容

本发明涉及到一种用于培养T淋巴细胞的无血清培养基的组成成分和制备方法。为达到提高安全性的目的，避免任何因为使用含动物来源的成分或人体来源的成分可能带入的传染性疾病，本培养基所使用的所有原料均为非动物源性的原料和非人体来源的原料。本培养基通过上述方法改进，安全性优于以往的T细胞培养基，同时培养效果得到进一步提升。 

具体来说，本发明由以下部分组成： 

一种用于体外培养T淋巴细胞的培养基，培养方法包括但不限于以下几个方面： 

a)T细胞的获取：T细胞可以来源于外周血、淋巴组织、骨髓、肿瘤组织、 胸腹腔积液等部位，在此过程中，为防止凝血，可加入肝素或枸橼酸做抗凝剂。 

b)T细胞的分离：取自上述部位的细胞种类繁多，如有必要可进一步提纯和分离得到纯度更高的T细胞，常用的分离方法包括Ficoll密度梯度离心法、免疫磁珠吸附法、贴壁吸附法、裂解法等。 

c)T细胞的培养：将细胞悬液用培养基配成细胞浓度每毫升10万个到500万个，接种到培养容器中，加入T细胞刺激因子，常用的包括IL-2、抗CD3单抗、IFN-r、抗CD28单抗、植物血凝素、抗原递呈细胞等，于37度、5％二氧化碳细胞培养箱培养扩增，一般培养7-30天。扩增倍数和杀瘤活性受培养基、刺激因子、细胞来源、氧气等因素的影响。 

d)T细胞的鉴定：一般采用流式细胞术检测，T细胞包括CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+等细胞群。 

本培养基由于在上述培养方法中，可以特异地支持T细胞的扩增和长期存活，表现为培养后，含有T细胞表型的细胞比例增加，细胞总数增加，因此用作T细胞的培养基。 

本发明内容中涉及到一种用于扩增活化T淋巴细胞的培养基，这种培养基的优点在于它不含有任何动物来源和人体来源的成分，因此有更高的安全性。