[发明专利]一种调控植物花粉育性的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程和植物育种技术领域，具体涉及一种通过将Barnase分成N端和C端两个片段，分别利用两个表达时期有重叠的花粉特异启动子驱动其在植物中的表达，从而加强Barnase表达的组织特异性、克服利用Barnase基因创建植物雄性不育系时毒性泄露问题的方法。

背景技术

杂种优势是生物界的一种普遍现象，利用杂种优势可以显著提高作物产量、品质和抗性。杂交育种已经成为许多作物选育新品种的主要途径，而作物雄性不育系的选育又是杂种优势利用中的关键环节。由于利用常规育种方法选育不育系存在周期长、见效慢、对环境因素影响敏感等问题而不能满足生产发展的需要，近年来，利用基因工程创建雄性不育系被作为最具前景的育种途径，成为当今世界范围内研究、开发和利用的热点。

目前利用植物基因工程创建雄性不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子驱动外源基因在植物中的表达来阻断花粉发育过程从而达到雄性不育的目的，如利用绒毡层特异启动子驱动Barnase基因在植物中特异表达获得基因工程核不育系或利用反义RNA技术特异关闭雄配子体发育关键基因获得基因工程核不育系等。

Barnase是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的一种胞外RNA酶，其产物以前体形式表达，在加工、运输过程中N端被切除约20个氨基酸，成为成熟酶，共有110个氨基酸。Barnase具有强烈的毒性，它在特定细胞中的微量表达就可以造成该细胞的死亡。1990年，Mariani等将具有特异时空表达特性的烟草花药绒毡层特异启动子TA29，与解淀粉芽孢杆菌的Barnase基因结合，构成嵌合基因，用根癌农杆菌介导法，将上述嵌合基因导入烟草和油菜，获得了转基因植物（Mariani C等，Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene，Nature，1990，347：737-741）。结果，有相当大一部分转基因植株花药皱缩、不散粉、自交不能结实，但雌蕊正常，可由其它植株授粉结实；组织切片未发现绒毡层，花粉囊变形，无小孢子和花粉粒。因此，他们认为，TA29-Barnase嵌合基因在油菜、烟草中的特异表达，选择性破坏了花的绒毡层，从而阻止了花粉的形成，导致雄性不育。

20年来，Barnase被导入油菜、烟草、棉花、小麦、玉米、水稻等各种作物进行了雄性不育诱导的研究。在利用Barnase创建植物雄性不育系的过程中也发现了一系列的问题，如Barnase蛋白的温度敏感性问题、驱动其表达的花粉特异启动子的特异性不够或上游有CaMV35S等强启动子而导致的毒性泄露问题等。

针对这一问题，本发明提出了一种新的雄性不育载体的构建策略，在该策略中将Barnase分成N端和C端两个片段，并且由两个不同的花粉特异启动子分别启动Barnase两个半分子Barnase-N和Barnase-C的表达，由于半分子Barnase-N和Barnase-C单独存在时都不具有RNA酶的活性，因此只有在两个启动子都具有表达活性的花粉细胞中才同时存在Barnase-N和Barnase-C两个半分子，而这两个半分子可以自我组装成具有RNA酶活性的复合体，行使RNA酶的功能，从而达到植株雄性不育的目的。本发明一方面沒有用强表达的组成型启动子（如CaMV35S启动子)，避免了强启动子对Barnase基因表达特异性的影响，更好的克服了Barnase基因的毒性泄露问题，更有效的实现了Barnase基因在创制植物雄性不育系方面的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的创建植物雄性不育系的方法，更具体的是提供一种在双子叶植物中创制雄性不育系的方法，所述方法包括选取两个花粉特异表达的启动子，更具体的是选取两个在双子叶植物的花粉中特异表达的启动子，将Barnase基因分成N端和C端，由两个启动子分别驱动表达。通过上述方法所获得的构建体在转入植株后，可以使获得的转基因植株实现雄性不育，并且能够有效避免Barnase毒性泄露问题，还能避免同时转入两个相同的启动子所导致的基因沉默问题。

本发明所涉及的Barnase基因蛋白，是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的一种胞外RNA酶，具有很强的细胞毒性，它在细胞中的特异性表达会造成细胞的死亡，因而被广泛应用于植物雄性不育系的创建等领域。