[发明专利]一种花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法

权利要求书

1.一种花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，其特征在于：通过收集花生不同生长时期的根际土壤，分别提取土壤基因组DNA，采用16S rRNA基因简并引物进行扩增，获得的PCR产物经均质化处理后纯化，用于构建16S rRNA基因文库，对得到的文库数据经分析比较，从而全面展示花生不同生长发育时期根际土壤的细菌群落结构。

2.根据权利要求1所述的花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，其特征在于：所述收集花生不同生长时期的根际土壤，其收集方法为：用无菌水将盆栽花生浇透，用铲子将整株花生植株铲出，大块土掉落后，收集附着在根部的土壤；整个操作过程要无菌操作，所用工具均用75%酒精消毒。

3.根据权利要求1所述的花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，其特征在于：所述收集花生不同生长时期的根际土壤，每个时期任意选择三株花生作为样本，所取三个土样充分混匀后用液氮速冻，冻存于-80℃冰箱保存备用。

4.根据权利要求1所述的花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，其特征在于：所述提取土壤基因组DNA，整个提取过程须保证无菌操作，所有环节均在冰上进行，所用试剂也要4℃预冷。

5.根据权利要求1所述的花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，其特征在于：所述采用16S rRNA基因简并引物进行扩增，所用引物为：

16S-F: 5’-AGNGTTTGATCMTGGCTCAG-3’N：A或G, M：A或C；

16S-R: 5’-GGGCGGWGTGTACAAGKCC-3’W：A 或T，K：G 或 C；

退火温度为55℃，扩增25个循环。

6.根据权利要求1所述的花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，其特征在于：所述采用简并引物进行扩增，所提基因组DNA作为PCR模板，首先设定浓度梯度，分别为0.1μl、0.25μl、0.5μl、1μl、和2μl，PCR扩增后选择最适浓度，重新扩增6管，每管25μl体系，均匀混合后纯化用于构建16S rRNA基因文库。

7.根据权利要求1所述的花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，其特征在于：所述对得到的文库数据分析比较，将所构建文库的所有阳性克隆进行测序，采用DOTUR程序分析每个文库中序列的分类单元，以3%的差异为标准，序列差异≤3%即作为一个分类单元。

8.根据权利要求1所述的花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，其特征在于：所述对得到的文库数据分析比较，采用OUT频率的log值，以2为底，作聚类分析，以减少PCR扩增的影响。

9.根据权利要求1所述的花生不同生长时期根际土壤细菌群落结构的分析方法，其特征在于：所述对得到的文库数据分析比较，以系统分类为比较单元，从而减少数据库登记已知序列有限所带来的序列比对误差，而又尽可能地细化序列分类。