[发明专利]荧光定量检测沙门氏菌免疫层析试剂盒

说明书

  

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体地说，本发明涉及一种荧光定量检测沙门氏菌免疫层析试剂盒。 

背景技术

食品是人类社会赖以生存和发展的物质基础，且随着食品安全事故频发造成的极其严重的人身和财产安全，食品安全成为了当今社会各界关注的焦点问题之一。 

沙门氏菌（Salmonella）是一种人畜共患的食源性致病菌。沙门氏菌属广泛分布于自然界中，在人和动物中有广泛的宿主。沙门氏菌污染肉类食物的概率很高，如家畜中猪、牛、羊、猫、犬，家禽中鸡、鸭、鹅等。动物源性食品是人类食物的重要组成部分。 细菌性食物中毒在动物源性食品中毒中最为常见, 且其中由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位。由沙门氏菌引起的食物中毒主要是由食用了受沙门氏菌污染的肉、蛋、奶等动物源性食品所引起。 

能引起食物中毒的沙门氏菌的菌种主要有猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等，它们能产生耐热毒素, 在75℃经 1 h 仍具有毒力, 因而常引起人的食物中毒。由于其在全球范围内的危害性与广泛性，世界各国学者进行了大量研究，以求建立一种快速、准确、高灵敏度、易操作且能够定量的沙门氏菌检测技术。 

常见的相关检测技术有：PCR，ELISA，LAMP，胶体金免疫层析法。 

聚合酶链式反应(PCR)技术，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成: 即在高温( 95℃ )下，待扩增的靶DNA 双链受热变性成为两条单链DNA 模板；而后在低温( 37 ~ 55℃ )情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA 模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度( 72℃ )下，以物3’ 端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→ 3’ 方向延伸，合成DNA 新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA 分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板， 每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA 特异区拷贝数扩增一倍， PCR 产物得以2n的指数形式迅速扩增,经过25 ~ 30 个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106 ~ 107倍。具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点。 

酶联免疫吸附法（ELISA），原理是包被抗体或抗原, 直接加入酶标记的抗原或抗体进行反应, 可用于目的抗原或抗体的直接检测。将ELISA 方法应用于食品中沙门氏菌的检测，通过单克隆抗体大大降低了假阳性率。但ELISA 方法的灵敏度较分子生物学方法低，且必须经过增菌筛选纯培养步骤，因此难以在短时间内得到检测结果。 

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种连续、恒温、基于酶反应的新型核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，利用具有链置换活性的DNA 聚合酶，可在65℃等温条件下扩增60 min，即可完成反应，将目的基因扩增109 ~1010 倍。LAMP是比分离培养更快速、灵敏的检测技术。该技术用于检测病原菌特异性强、灵敏度高，等温高效，整个扩增反应操作简便、快捷，实验装置简单、费用相对较低；但LAMP 技术对试验设计的要求较高, 需要设计的引物数目相对较多、结构复杂，需要考虑到靶序列的片段及茎环结构等因素，在检测高度变异的病原体时，实验设计相对比较困难，在一次反应中只能检测一个病原体，而且阳性反应并不只呈现单条带， 而出现拖尾和一些低分子质量的带, 一旦产生非特异性扩增，则不易鉴别。 

胶体金免疫层析技术(GICA)，是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，其原理是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体 (抗原或抗体) 发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域 (检测带)，运用可目 测的标记物 (胶体金) 而得到直观的实验现象 (显色) 。但这种方法中标记物的稳定性较差，颜色单一，灵敏度较低，受基质的背景干扰大，且只能定性检测，不能做到精确定量。但该技术具有便捷、快速、准确和无污染等特点被广泛应用医学检测和临床诊断，在病原体检测方面，其敏感性、特异性具有其他免疫学方法无可比拟的优势，且该方法无需特殊仪器设备，对检测人员的专业要求低，有良好的基层应用开发前景。