[发明专利]一种诱导博落回花药离体单倍体胚胎发生及植株再生的方法

权利要求书

1.一种诱导博落回花药离体单倍体胚胎发生及植株再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）外植体的采取与消毒：取处于盛花期的，长度在2-12mm的博落回花蕾消毒后，将花蕾轻轻拨开，拔取雄蕊，切除花丝，留下花药作为外植体，备用；

2）胚性愈伤组织的诱导培养：将步骤1）消毒的花药接种到BLCG+2，4-D0.5～3.0mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上，在温度25±1℃，光照强度1000～3000Lx，光照时间16～18h/d的条件下进行胚性愈伤组织的诱导，培养30～40d后得到愈伤组织；

3）花药胚状体诱导培养：将步骤2）得到的愈伤组织转接后形成胚状体；

4）体细胞胚胎萌发与成苗培养：将步骤3）得到的胚状体转接后形成生根的完整植株；

5）再生苗的移栽与培养：将生根苗移栽到炼苗基质中炼苗后，再进行正常的水肥管理。

2.根据权利要求1所述的诱导博落回花药离体单倍体胚胎发生及植株再生的方法，其特征在于，步骤1）所述的外植体的采取与消毒的过程具体为：取处于盛花期的，长度在2-12mm的博落回花蕾，用蒸馏水清洗，在超净工作台上用无菌水冲洗干净；用70%酒精浸泡10s，再用0.1%升汞溶液浸泡8～10min消毒灭菌后用无菌水冲洗3～4次；将花蕾轻轻拨开，拔取雄蕊，切除花丝，留下花药作为外植体，放于无菌干燥的滤纸上吸干水分，备用。

3.根据权利要求1所述的诱导博落回花药离体单倍体胚胎发生及植株再生的方法，其特征在于，步骤3）所述的花药胚状体诱导培养过程具体为：将步骤2）得到的愈伤组织转接到MS+2，4-D0.5～1mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上，在温度25±1℃，光照强度1000-3000Lx，光照时间16-18h/d的条件下进行胚状体的诱导培养，20天后形成胚状体。

4.根据权利要求1所述的诱导博落回花药离体单倍体胚胎发生及植株再生的方法，其特征在于，步骤4）所述的体细胞胚胎萌发与成苗培养过程为：将步骤3）得到的胚状体转接到MS+GA₃0～1mg/L+IAA0～0.25mg/L+KT0～0.25mg/L培养基上，在温度25±1℃，光照强度1000-3000Lx，光照时间16～18h/d的条件下培养10～15天形成生根的完整植株。

5.根据权利要求1所述的诱导博落回花药离体单倍体胚胎发生及植株再生的方法，其特征在于，

步骤5）的具体过程如下：将生根苗，移栽到泥炭土：木质泥炭土：椰糠粉：蛭石=1:1:1:1的炼苗基质中，浇透水，并用塑料小棚罩住小苗，保证棚类湿度不低于80%，在温度25±1℃，光照强度为3000lx下培养，小苗适应培养环境两周后，移除塑料棚，进行正常的水肥管理。

6.根据权利要求1-5任一项所述的诱导博落回花药离体单倍体胚胎发生及植株再生的方法，其特征在于，

胚性愈伤组织诱导培养基：BLCG+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L；

花药胚状体诱导培养基：MS+2，4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L；

体细胞胚胎萌发与成苗培养基：MS+GA₃0.5mg/L。