[发明专利]利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法

权利要求书

1.一种利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于包括如下具体步骤：

（1）通过PCR，在SEQ ID NO.1的序列的5’端添加AvrⅡ酶切位点，在3’端添加Not I酶切位点，得到带有AvrⅡ和Not I酶切位点的序列；接着通过Avr Ⅱ和Not I酶分别双酶切pPIC9K载体和前述带有AvrⅡ和Not I酶切位点的序列；然后将酶切后的载体和序列连接，得到A4-Prx基因插入pPIC9K载体上的重组质粒pPIC9K-A4-Prx，将其转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中，得到重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4-Prx；

（2）将重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4-Prx接种于BMGY培养基中，振荡培养至OD₆₀₀为2～6，离心收集菌体；洗涤，用无菌BMMY液体培养基将菌体重悬，控制菌悬液OD₆₀₀值为0.9～1.1；28～30℃，200～250r/min下每24h添加甲醇，连续诱导培养3d后，室温离心收取上清液，即得到重组过氧化物A4-Prx粗酶液；

（3）将步骤（2）的重组过氧化物A4-Prx粗酶液与食品样品液混合，反应后，即得到降解玉米赤霉烯酮后的食品样品液。

2.根据权利要求1所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤（2）所述的BMGY培养基的pH值为6～8；所述的BMMY液体培养基的pH值为6～8；所述的BMMY液体培养基中含有0.5%体积浓度的甲醇用于诱导。

3.根据权利要求1所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤（2）所述的添加甲醇指添加至甲醇的终体积浓度为0.5%。

4.根据权利要求1所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤（2）所述的振荡培养指在28～30℃，振荡频率为200～250r/min下培养18h。

5.根据权利要求1所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤（2）所述的离心收集菌体指在速率为4000～5000r/min下离心5～10min。

6.根据权利要求1所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤（2）所述的离心收取上清液指在速率为8000～12000r/min下离心5～10min。

7.根据权利要求1所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤（3）所述的食品样品液由以下方法得到：取1g粉碎的食品，加入4mL体积分数为84%的乙腈水溶液，常温200r/min速率下振荡1h，静止放置，得到食品样品液。

8.根据权利要求1所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤（3）所用重组过氧化物A4-Prx粗酶液的量为每4mL食品样品液使用160mL粗酶液，并添加40mL0.25mol/L Tris-HCl（pH8.5）缓冲液和8mL0.5mol/L H₂O₂水溶液混合均匀。

9.根据权利要求1所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤（3）所述的反应是在40℃下反应12h。

10.根据权利要求1所述的利用重组毕赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：步骤（3）所述的食品指谷物类食品。