[发明专利]利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌及构建方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用甘油生产琥珀酸的菌株及其构建方法和应用。

背景技术

琥珀酸又称丁二酸，它作为一种重要的原料在医药、食品、塑料、油漆、农药、染料以及表面活性剂等行业有着广泛的用途。它还是一种重要的平台化合物，可用于合成四氢呋喃、n‐甲基吡咯烷酮、2‐吡咯烷酮及丁二醇等。

琥珀酸的合成方法包括化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法由于其环境污染小，成本低，越来越受到各国科研工作者的关注。微生物发酵法生产琥珀酸所用的菌株主要包括产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌等。其中大肠杆菌作为研究最多的模式微生物，其代谢途径比较清楚，基因组信息和调控信息比较全面，各种基因操作手段比较成熟，因此大肠杆菌被广泛用来通过代谢工程的手段生产琥珀酸。近年来由于生物柴油产业的迅猛发展，甘油作为其主要的副产物成为了一种廉价和丰富的工业微生物发酵原料。通过微生物发酵的方式以甘油为底物来生产有价值的化工产品和能源例如有机酸、1,3‐丙二醇、乙醇和氢气等成为目前研究的热点。利用大肠杆菌以甘油为底物生产琥珀酸的研究主要使用厌氧条件或微好氧条件，通过失活副产物途径和增强羧化途径来提高琥珀酸产量。但是由于大肠杆菌在厌氧条件或微好氧条件下的甘油利用速率和生长速率非常缓慢，因此琥珀酸生产速率也相对较低，从而限制了工业化生产。

构建好氧条件的琥珀酸生产菌株普遍使用的代谢工程策略包括失活琥珀酸脱氢酶使琥珀酸作为终产物积累、敲除副产物生成途径、增强羧化途径和激活乙醛酸循环作为第二条琥珀酸生产途径等。乙醛酸循环作为其中一条琥珀酸生成途径对于提高琥珀酸产量有非常重要的作用。由于乙醛酸循环受到许多因素的调控，因此通过基因工程的手段调控其通量效果比较有限。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能在好氧条件利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌。

本发明的第二个目的是提供一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌（Escherichia coli），其保藏编号为CGMCC NO.7999。

一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的构建方法，包括如下步骤：

（1）敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并过量表达乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶，得到进化的出发菌株；

（2）将步骤（1）获得的菌株通过在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中连续转接培养的方式进行进化，得到能够在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中生长的并且乙醛酸循环的通量得到增强的进化菌株；

（3）将步骤（2）获得的菌株通过敲除琥珀酸脱氢酶基因、过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脱氢酶系，得到利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。

一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的用途，包括如下步骤：

在发酵罐中，装入以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基，以6%-8%的体积比将一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌接入所述培养基中，在28-40℃，通气速度为0.5-1.5vvm，通过调节搅拌速率控制溶氧在饱和溶氧的30%以上，全程控制pH在6.8-7.3，发酵50-60小时，得到含琥珀酸的发酵液。

本发明的优点：

本发明采用定性途径进化的方式来增强乙醛酸循环的通量，这种进化方式具有途径定向性，且未见公开，可广泛应用于潜在途径的激活。本发明得到了能够高效利用甘油为底物生产琥珀酸的菌株。本发明的发酵条件可以加快菌体生长速度，提高菌体密度，从而提高甘油生产琥珀酸的生产速率。

附图说明

图1为菌种构建示意图。

图2为代谢网络图。

图3为实施例1中敲除ppc基因的电泳鉴定图。

图4为实施例1中置换aceBA启动子的电泳鉴定图。

图5为实施例3中敲除sdhCDAB的电泳鉴定图。

图6为实施例3中置换ppc启动子的电泳鉴定图。

图7为实施例3中置换sucAB启动子的电泳鉴定图。

具体实施方式