[发明专利]一种假俭草总DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明属于草业学科中的分子生物学领域，特别涉及一种假俭草总DNA提取方法。

背景技术

假俭草（Eremochloa ophiuroides(Munro.)Hack.），又称百足草、蜈蚣草，为禾本科蜈蚣草属多年生宿根性优良草坪植物，也是蜈蚣草属中唯一可用作草坪草的物种。假俭草除在东南亚有很少量分布外，在我国长江流域及以南地区的丘陵山地、平原以及各类湿地广泛分布，是国外公认的起源于中国的最好的暖季型草坪草，所以称之为“中国草坪草”。该草以耐瘠薄、病虫害少及养护要求低而著称，所以国外又称之为“懒人草”。此外，假俭草有非常好的耐酸性，其耐酸性是禾本科中最强的，可以在江西等强酸性红壤地区生长繁殖，这在草类物种中也非常少见。假俭草可广泛用于庭院草坪、休憩草坪及护坡草坪的建植，特别适合于水土保持和大面积景观建设，是世界三大暖季型草坪草之一。假俭草不仅可以用作草坪草，也是很好的牧草，为牛羊等草食动物喜食。随着全球水资源和能源的日益紧张以及人们环保意识的不断增强，选择质地适中、适应性强及养护要求低的草种已是草坪草品种选育的主要目标，而假俭草非常符合这一发展趋势。因此，在国内外假俭草越来越广泛地应用于草坪生产和环境绿化。

总DNA的提取是分子生物学实验的非常关键的一个环节，其质量直接影响分子生物学实验中与DNA有关的后续实验的进行。假俭草是一种富含次生代谢物质的一个物种，传统的DNA提取方法不易提取得到高质量的总DNA。由于次生代谢产物的种类及其复杂，不同物种，同一物种不同季节，不同年龄的叶片之间的次生代谢产物也有较大区别。因此，一种植物的总DNA提取方法往往不能很好的应用于另一种植物总DNA的提取。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种可分离出纯度高，完整性好的假俭草总DNA提取方法。

本发明是通过以下技术方案得以实现的：

一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于：具体操作步骤如下：

（1）称取0.2g假俭草，置于液氮研磨机中研磨，磨细后的假俭草转移至2mL的离心管中；

（2）在2ml离心管中加入0.7mL的CTAB提取缓冲液和14μL β-巯基乙醇，盖上离心管盖，混合均匀，在65℃水中温浴30min，期间颠倒混匀5-6次；

（3）将温浴后的样品取出，冷却至室温，向2ml离心管中加入0.7mL含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，盖上离心管盖，上下颠倒充分混匀，置于离心机，在转速11000rpm离心15min，吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中；

（4）在1.5mL离心管中加入150μL硅珠悬浮液，用涡旋震荡器混匀，室温静止10min后，在涡旋震荡器上涡旋震荡5s，再置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物；

（5）将步骤（4）得到硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋，使其完全分散，然后加入0.7mL漂洗液，充分混匀，置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物；

（6）重复步骤（5）一次；

（7）将步骤（6）得到的硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋分散，加入1mL70%酒精将硅珠-核酸复合物漂洗两次，再用无水乙醇漂洗一次后，将硅珠-核酸复合物自然风干；

（8）向装有步骤（7）得到的硅珠-核酸复合物的离心管中加入100μL TE缓冲液，并在涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使之充分分散，在56℃水中温浴10min后，置于离心机在转速11000rpm离心5min，吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中,得到分离物硅珠和上层清液；

（9）将步骤（8）中得到的硅珠置于涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使硅珠和残留的核酸充分分散，再向其加入100μL TE缓冲液，置于涡旋震荡器中进行充分涡旋震荡后，在56℃温浴10min，置于离心机在转速12000rpm离心5min，吸取上层清液，装入步骤（8）中上层清液的1.5ml离心管；将该离心管置于离心机在转速12000rpm离心10min，吸取上层清液，并加入400μL TE缓冲液，充分混匀，得到混合液；

（10）向装有步骤（9）的混合液的离心管中加入600μL含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，混匀；置于离心机在转速12000rpm离心10min；吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中；

（11）重复步骤（10）一次；