[发明专利]含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对遗传毒性化合物的检测。

背景技术

酿酒酵母是一种简单真核生物，单细胞，遗传改造操作简单，培养简便快速且环境友好，适合作为一种模式生物应用于生命科学研究。1996年酿酒酵母全基因组序列分析作为第一个真核生物全基因组序列信息被公布，约有5800个基因序列信息被获得而其中大约有23%基因与人类同源，因此酿酒酵母作为一种简单的模式生物因其已知的全基因组序列信息可为深入研究真核生物乃至高等生物生命机制提供基础。

基于已知的酿酒酵母全基因组序列，斯坦福大学研究人员为主的多个实验室构建得到酿酒酵母单基因缺失株文库（Saccharomyces Genome Deletion Project）（Giaever et al.,Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiaegenome,2002,Nature418(6896):387-391.），该文库以野生型酿酒酵母菌株作为背景菌株，利用以PCR为基础的基因敲除策略（PCR-based gene deletion strategy），根据基因同源重组原理逐个对酿酒酵母基因组中的每一个基因进行敲除，最后共得到5396个分别单基因敲除的突变株。由PCR介导的基因敲除策略，即将酵母基因组中每个基因的开放阅读框（ORF）被卡那霉素抗性基因（KanMX）同源重组置换，并利用G418抗性对基因敲除菌进行筛选。PCR扩增KanMX基因所用到的引物由四部分组成，其中包括（1）酵母目的基因ORF片段前18bp同源序列；（2）18bp通用引物U1、D1；（3）一段20bp长度的仅标示、鉴定目的缺失基因的特异条形码序列（barcoding sequence），即每一个酵母基因都对应一条特异性条形码序列；（4）18bp与KanMX基因同源的序列。

目前该文库的应用主要是建立一种合成致死筛选微阵列（Synthetic genetic array,SGA）方法即通过检测细胞生长速率和致死性来研究酵母中基因功能及分子机制（Baryshnikova et al,Synthetic Genetic Array(SGA)Analysis in Saccharomyces Cerevisiae and Schizosaccharomyces Pombe,2010,Meth ods in Enzymology,Vol470:Guide to Yeast Genetics:470:145-179.）并应用于一些化合物毒性的分析。而Boone等人利用SGA手段已绘制了酿酒酵母全基因组范围内的双基因缺失遗传相互作用图谱（Boone et al.,The genetic landscape of a cell,2010,Febs Journal277:7-8.），其中可定量分析基因间相互作用的基因占全基因组的75%，为酿酒酵母遗传相互作用的研究提供了一个高通量、覆盖面全、意义重大的有力工具。但是这种以致死性为检测指标的分析，限制了对一些化合物的非致死性生物毒性的检测和分析，比如一些遗传毒性化合物，它们可能不会致死，但具有DNA损伤效应。如果将DNA损伤响应的生物传感器转入到酵母单基因缺失文库中，将会扩展文库的应用范围，开展高通量、特异性遗传毒性化合物易感基因群的筛选。

基于酵母DNA损伤响应的生物传感器是一种用于检测环境遗传毒性化合物的检测系统，该类型生物传感器的构建需具备以下两个基本元件：感应元件和连接于此后的效应元件。前者利用其自身功能可对DNA损伤进行响应，并开启后者的表达，从而产生可检测出的信号。基于酵母DNA损伤响应的生物传感器RNR3-yEGFP（专利申请号201210269407.5）、酵母灵敏型遗传毒性致癌物检测系统HUG1-yEGFP（专利申请号201210263302.9）即分别利用RNR3、HUG1两种基于DNA损伤转录应答的基因启动子作为生物传感器的感应元件，yEGFP酵母增强型绿色荧光蛋白作为效应元件构建而成，这两种生物传感器可检测多种遗传毒性致癌物，可应用于高通量的遗传毒性致癌物环境实时现场监测。