[发明专利]膜片钳实验内面向外式膜片形成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞膜片钳实验的改进方法，特别涉及一种膜片钳的内面向外式膜片形成的方法，属于生物细胞实验领域。

背景技术

内面向外式，即inside-out模式，是膜片钳实验中很重要和常用的方式，在这种构型下，细胞膜的内侧面暴露于实验浴液中，通过置换浴液或直接在浴液中加入测试物质，可以较易改变细胞内侧的离子或物质浓度，也能把酶或药物等直接加入膜的内侧面，是研究调控物质对通道内口的作用以及胞内调控物质对单通道电流特性影响的必须手段。

在形成细胞膜内面向外式构型的过程中，先用微管玻璃电极与细胞膜接触，经负压抽吸形成高阻封接，然后提起电极，将电极尖端钳制的细胞膜从细胞上撕脱下来，由于细胞膜的流动性，电极尖端游离的细胞膜残片自发融合在一起，形成细胞膜囊泡。浴液中的各种离子对囊泡的稳定性有很大的影响，其中Ca²⁺与蛋黄卵磷脂头基有很强的结合能力，浴液中Ca²⁺的存在可以使细胞膜磷脂双层之间作用力的平衡状态发生改变，进而改变磷脂双分子层中疏水链的排列，使膜增厚、刚性增强，囊泡结构更稳定。因此，在常规技术方案中，往往需要将电极提出液面，短暂暴露在空气中，使囊泡破裂才能形成内面向外式构型，再放入浴液中进行测试。

然而，当使用高钙溶液时，由于钙离子浓度的升高，组成囊泡的磷脂双分子层的稳定性随之增强，主要表现在以下几个方面：

一方面，Ca²⁺与蛋黄卵磷脂头基有很强的结合能力，浴液中Ca²⁺的增高可以使细胞膜磷脂双层之间作用力的平衡状态发生改变；另一方面，由于高浓度溶液的静电屏蔽作用，膜表面电荷的相互作用势减小，结果使相互作用斥力也随之减小；再一方面，由于离子浓度的升高，使磷脂分子相互之间绑定地更加紧致。此外，随着离子浓度的增加，使极性亲水端的相互作用不断减弱，同时，疏水链之间的相互作用能不断增加，即斥力减弱，引力增强，两者共同作用使磷脂双层膜趋于更加稳定，囊泡结构更加牢固，不易破裂。

在传统inside-out模式膜片钳实验中，使用高钙浴液时，电极尖端游离细胞膜残片自发融合形成的囊泡结构更加牢固，稳定性更强，在空气中短暂暴露无法有效的使该囊泡破裂形成单层膜片，或者电极尖端的囊泡在空气中暴露后形成了单层膜片，但稳定性差，浸入高钙浴液后囊泡又再次形成，类似情况都无法进行后续的实验操作。按照现有的常规技术方案，在发生电极尖端囊泡无法有效破裂或反复形成的现象时，实验人员只有被迫终止实验，这严重影响inside-out模式膜片钳实验的成功率及实验效率。因此，如何能够使电极尖端形成单层膜片不仅是inside-out模式膜片钳实验的技术要点和技术难点，更是提高实验成功率和实验效率的关键所在。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中进行inside-out模式膜片钳实验时玻璃微电极尖端游离细胞膜会自动融合形成囊泡，并且经过常规方案处理后仍不能使囊泡破裂形成单层膜片的缺陷，提供一种快速有效消除囊泡，形成内面向外式膜片的实验方法。本发明的方法能保证后续实验能够顺利进行，显著提高了膜片钳实验的成功率。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种膜片钳实验内面向外式膜片形成方法，用常规技术手段进行内面向外式膜片钳实验，在实验过程中，当电流记录过程中检测到的电流信号减小或消失时，表明电极尖端游离细胞膜融合形成了囊泡，将电极从浴液中提起暴露于空气中，直接对电极尖端的游离细胞膜融合形成的细胞膜囊泡吹气，使该细胞膜囊泡破裂，将电极放入浴液中，内面向外式膜片形成。

上述膜片钳实验内面向外式膜片形成方法中，所述电极尖端游离细胞膜融合形成的囊泡，可以是实验过程中电极尖端钳制的细胞膜从细胞上撕脱后首次形成的囊泡；也可以是经过常规空气中短暂暴露处理后形成的内面向外式膜片在浴液中又再次融合形成的囊泡。

上述膜片钳实验内面向外式膜片形成方法中，对细胞膜囊泡吹气的气压强度，最好为0.3～0.5mbar；吹气时间最好为0.5～1.5秒。

进一步，所述吹气过程是在距离电极尖端20-30cm处，使用脚踏式充气筒吹气，气流压强为0.3～0.5mbar，吹气持续时间为0.5～1.5秒。

进一步，所述吹气过程是在距离电极尖端20-30cm处，用微型电动空气泵吹气，气流压强为0.3～0.5mbar，吹气持续时间为0.5～1.5秒。吹气完成后，电极尖端的细胞膜囊泡破裂，将电极放入浴液中，内面向外式膜片再次形成。