[发明专利]制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说，涉及制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用。 

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是一类具备无限自我更新和分化潜能的早期胚胎细胞，是当受精卵分裂发育成囊胚时内层细胞图案的细胞，其具有可以向各胚层范畴的细胞分化的能力。成体细胞是指存在于人和哺乳动物特定组织或器官中（包括骨髓、神经、肌肉、表皮、睾丸或肾脏等）的具有修复和再生能力的干细胞，在特定条件下，成体干细胞产生新的干细胞或按一定的程序化形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡，与胚胎干细胞不同的是，成体干细胞只可以向其定居的组织类型分化。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。睾丸里的生殖干细胞，是睾丸中所有精细胞和内分泌细胞的母亲细胞、种子细胞。睾丸里的生殖干细胞在男性和雄性动物的生命进程中，是一个进行性和累计性的消耗过程。生殖干细胞的消耗殆尽时，睾丸老化，丧失生精和排精功能，荷尔蒙降低，男性和雄性动物进入老年。因此，生殖干细胞的消耗，睾丸功能枯渴，睾丸衰老与男性和雄性动物的整体衰老及寿命的长短有密切关联。 

现在国际上主要采用两种方法制备生殖干细胞。一种方法是通过自然的胚胎干细胞体外分化形成异体生殖细胞，应用于研究领域，；第二种方法是从睾丸或卵巢分离培养制备自体生殖干细胞，应用不孕不育的治疗领域，分离培养耗时困难，生殖细胞来源困难，获取数量极其稀少。 

应用自体生殖干细胞移植，进行衰老睾丸的再生和再造，是延缓睾丸衰老，恢复和提升机体各种机能和延长寿命的有效方法。但是，如何获得足够数量、安全性低的男性和雄性动物自体生殖干细胞，是一个有待研发的医学生物学难题。 

发明内容

针对现有技术中获取的男性和雄性动物自体生殖干细胞数量少、安全性低的问题，本发明提供了一种制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法，该方法包括： 

将体细胞以5×10⁶的密度接种于细胞培养皿中。体细胞包括但不限于雄性动物的脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞等。 

在37℃和5%的CO₂的环境中，将体细胞或单个核细胞在细胞培养液A（RPMI 1640培养液）中培养1-3天。培养液A中含有： 

1-100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632（C₁₄H₂₁N₃O.2HCl），优选值为10μM； 

1-100ng/ml的干细胞因子，优选值为10ng/ml； 

1-100ng/ml的白细胞介素3，优选值为10ng/ml； 

1-100ng/ml的白细胞介素6，优选值为10ng/ml； 

1-100ng/ml的白细胞介素11，优选值为10ng/ml； 

1-100ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），优选值为10ng/ml； 

1-100ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF），优选值为10ng/ml； 

1-100μg/ml的岩藻多糖，优选值为10μg/ml； 

1-100μg/ml的葡聚糖硫酸酯，优选值为10μg/ml； 

1-100nM的AMD 3100（1,1′-[1,4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1,4,8,11），优选值为10nM； 

1-100μM的M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE），优选值为10μM；以及 

1-100μM的氨羟二磷酸二钠，优选值为10μM。 

在37℃和5%的CO₂的环境中，将体细胞或单个核细胞在细胞培养液B （DMEM培养液）中培养1-6天。培养液B中含有： 

1-100μM的RHO激酶抑制剂Y-27632（C₁₄H₂₁N₃O·2HCl），优选值为10μM； 

1-100μM的1-磷酸-神经鞘氨醇，优选值为10μM； 

1-100μg/ml的骨形态发生蛋白2（BMP-2），优选值为10μg/ml；