[发明专利]重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白及该蛋白抗体的制备方法

权利要求书

1.一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，其特征在于，该蛋白的基因序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种要求1所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白NGAL抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白重组表达，所述目的片段为序列表中SEQ ID NO.1所述蛋白质序列；

（2）重组NGAL的合成：将选定的目的片段通过PCR扩增后插入到表达载体，然后进行转座，最后转染宿主细胞，病毒在复制的同时，目的蛋白也将得到表达；

（3）重组NGAL的分离纯化:采用Ni柱纯化，包括蛋白提取和蛋白纯化；

（4）制备兔抗重组NGAL抗体：用步骤（3）纯化后的重组NGAL作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组NGAL抗体的抗血清。

3.根据权利要求2所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）后，对抗重组NGAL抗体的抗血清进行分离纯化，得到抗重组NGAL抗体干粉。

4.根据权利要求2所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述NGAL蛋白质序列的引物信息为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求2所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中表达载体选自为pFastBacTM 1、pFastBacTM HTA、pFastBacTM HTB、pFastBacTM HTC和pFastBacTM Dual。

6.根据权利要求2所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中转染的宿主细胞为昆虫细胞系，所述昆虫细胞系为昆虫sf9细胞系。

7.根据权利要求2或6所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中蛋白提取为：收集培养的细胞系，离心弃上清；沉淀细胞用NTA-0缓冲溶液溶解；向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上处理一段时间；将反应体系倒入烧杯中于冰上超声处理；后用离心机离心取上清再离心一次，后过0.22μm的滤膜；蛋白纯化为：取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗涤Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-0缓冲溶液洗涤Ni柱；后用NiSO4洗涤Ni柱，流干；再用NTA-0缓冲溶液洗涤Ni柱至流出液与NTA-0缓冲溶液pH值相同；以1mL/min速度上样；用NTA-0缓冲溶液洗涤至G250不变蓝为止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，跑胶分析溶液中重组NGAL纯度。

8.根据权利要求2所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）兔抗重组NGAL抗体的制备为：取重组NGAL与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500μg/只，首次免疫注射后第2周进行一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，加强免疫时取重组NGAL与等体积的不完全弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500μg/只，静脉采血，得到含抗重组NGAL抗体的抗血清。

9.根据权利要求8所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）可以采用羊来制备羊抗重组NGAL抗体。

10.根据权利要求3所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述抗重组NGAL抗体的抗血清进行分离纯化为：1）制备NGAL亲和层析柱：将NGAL蛋白与压积CNBr-Sepharose4B混合，依次经过交联、清洗、封闭、再次清洗、装柱、平衡，得到NGAL亲和层析柱；2）亲和层析：将NGAL抗体溶液通过1）所制备的亲和层析柱，去除非特异性吸附后进行解吸，分段收集解吸液；3)抗体获取：将2）收集解吸液，透析，冷冻干燥，得到NGAL抗体干粉。