[发明专利]一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法

权利要求书

1.一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1、大熊猫IL-2全基因克隆；

A11大熊猫外周血淋巴细胞体外培养；

无菌条件下采取健康大熊猫抗凝血2ml，置于EDTA-Na₂真空管中，然后往里加入等量D-Hanks液稀释；缓慢加入4ml淋巴细胞分离液于稀释后的大熊猫外周血中，2000r/min离心20min；小心将白细胞移于另一试管，加等量RPMI1640液，2000r/min离心15min，去上清，沉淀物再加入4mlRPMl1640液，洗涤2次，去上清；沉淀淋巴细胞用含10μg/mL ConA、10％小牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640液悬浮，取10μL细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5×10⁶个/mL，分装于细胞培养瓶中，CO₂培养箱中37℃培养24h；

A12总RNA提取；

A13cDNA的合成；

以上步抽提的总RNA为模板，按照Prime Script^TM RT reagent kit反转录试剂盒的操作步骤进行反转录；

A14引物的设计与合成；

根据GenBank中已报道的大熊猫IL-2cDNA序列，运用引物设计软件Oligo6.0设计两对扩增IL-2全基因的引物，具体序列如下表所示：

A15目的基因的PCR扩增；

以大熊猫基因组cDNA为模板，以IL-2P1/P2为引物进行PCR扩增；反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，58℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环；72℃延伸10min；于10℃保存；

A16目的基因PCR产物的TA克隆；

A161目的片段的回收；

A162目的片段与克隆载体连接；

将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接，16℃连接过夜；

A163DH5α感受态细胞的制备；

A164连接产物的转化；

A17重组质粒的初步鉴定；

A2、大熊猫白介素2的原核表达、多克隆抗体的制备；

A21引物设计与合成；

根据大熊猫IL-2基因测序结果，运用Oligo7.0设计一对引物：IL-2P1/P2；扩增编码IL-2成熟肽的cDNA碱基序列；

A22目的片段的PCR扩增；

以重组质粒pMD18-T-IL2作为模板，加入合成的特异性引物IL-2P1/P2，进行PCR扩增；反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，60.8℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环；72℃延伸10min；于10℃保存；

A23目的基因的TA克隆；

A231IL-2的TA克隆；

A24重组质粒的初步鉴定；

A25原核表达载体的构建；

A26重组表达菌株的培养及表达；

A27原核表达条件的优化；

A28重组表达蛋白的可溶性检测。