[发明专利]一种新型狂犬病疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种新型狂犬病疫苗及其制备方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒引发的以侵犯中枢神经系统为特征的致死性人畜共患传染病。狂犬病在全球每年导致5万多人死亡，给生命健康和社会经济造成巨大影响。狂犬病毒是单股负链RNA病毒，属于弹状病毒科弹状病毒属，外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜。狂犬病毒外膜上的糖蛋白(Gp)抗原是病毒表面棘突的成分，有凝集细胞的能力，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有嗜神经性；糖蛋白能诱导机体产生中和抗体并诱导细胞免疫，中和抗体对于病毒感染具有完全保护作用。按世界卫生组织(WHO)的要求，人或动物血清狂犬病毒中和抗体的效价高于0.5IU/ml被认为达到有效保护水平(Nishizono A等，Evaluation of an improved rapid neutralizing antibody detection test(RAPINA)for qualitative and semiquantitative detection of rabies neutralizing antibody in humans and dogs.Vaccine.2012;30(26):3891-6)。

病犬是狂犬病主要的传染源，其次是猫、猪及狐狸等各种野生或家养动物。狂犬病毒主要的传播方式是经咬伤传播或病犬唾液经损伤的粘膜或皮肤而入侵。另有报道证实狂犬病毒可通过气溶胶散布传播，动物通过吸入途径使狂犬病毒进入嗅神经末梢从而迅速到达中枢神经系统。因此犬等与人类密切接触是导致人狂犬病发病率居高不下的重要因素。接种狂犬病疫苗是预防和控制狂犬病发生的有效途径，目前广泛采用的原代细胞培养疫苗和传代细胞精制纯化疫苗由于生产成本昂贵，给药次数较多，以及需要联合佐剂等诸多限制因素，不便应用于狂犬病毒储存宿主的免疫接种。因此，在我国，制备质优、价廉、方便、易接种的狂犬病疫苗对于预防控制动物狂犬病十分重要。有效控制狂犬病毒的传染源、切断其传播途径有赖于新一代基因工程疫苗的发展。

腺病毒载体在疫苗研究以及基因治疗方面的应用已取得一定成果，如重组腺病毒AdHu5表达p53(“今又生”)已在肿瘤基因治疗方面发挥重要作用。在病毒防治的研究中，利用腺病毒载体表达外源基因制备重组基因工程疫苗以及通过结合RNA干扰技术来阻碍病毒依赖宿主的生活周期等均有广泛报道。腺病毒作为载体应用于疫苗的开发具有以下优点：①感染的宿主范围广，能感染分裂和非分裂细胞，导入细胞的效率较高。②遗传背景清楚，致病性低，不整合到染色体中，不会导致插入突变。③外源基因表达水平高，可以容纳约8-10kb的外源基因，能同时表达多个基因。④增殖速度快，易培养，可以产生较高的病毒滴度，适用多种途径免疫。⑤免疫原性强，能够协同外源蛋白引起强烈的特异性细胞免疫和体液免疫。基于上述优点，腺病毒是一种大有潜力值得试验和推广的疫苗载体，在新型基因工程疫苗研究中越来越显示出良好的应用前景。

由于常用的人血清型腺病毒如AdHu5、AdHu2等普遍感染人，因此人群中60-80%的个体存在相应的中和抗体，将削弱以AdHu5、AdHu2等为载体的疫苗的免疫效果。为克服这个问题，开发稀有人血清型或来自其它动物来源的腺病毒为疫苗或基因治疗载体是有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种狂犬病疫苗及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种狂犬病疫苗载体，所述表达载体包括：复制缺陷型重组腺病毒载体，以及连接于该载体酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I之间的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的编码序列；

其中，所述的复制缺陷型重组腺病毒载体包括：改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中，E1的大部份编码序列由连接序列(Linker)替换；所述的连接序列中设置酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I。

在一个优选例中，所述的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的编码序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述的连接序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的复制缺陷型重组腺病毒载体制备方法为：

将黑猩猩型腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中E1的大部份编码序列；

所述的4个片段分别是：