[发明专利]一种DNA病毒基因组的定点改造方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA病毒基因组的改造方法，尤其涉及DNA病毒基因组的定点改造方法。

背景技术

目前对于DNA病毒基因组的定点突变，主要有两种方法，一种方法是借助于限制性内切酶等工具酶对病毒基因组进行细胞外的基因重组操作，但对于较大的病毒基因组，很难找到可以使用的限制性酶切位点。另一种方法是借助于细胞内的同源重组系统，通过向病毒感染细胞中转染与病毒基因组相似的同源序列，完成对特定区域基因组序列的定点编辑，由于这种同源重组效率极低，因此并不适合高通量的病毒疫苗株筛选，为了克服这种困难，往往需要向病毒导入外源性抗性基因用于重组病毒的筛选，这种操作不但费时费力，而且在生物安全性上并不适合疫苗株的要求。如何简单、高效、精确地对大型DNA病毒基因组进行定点编辑，仍是疫苗开发中的一个技术瓶颈。

基于病毒的载体有很多种，常用的载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺联病毒、慢病毒、单纯疱症病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒以及多种病毒组装的嵌合病毒等。DNA病毒由于基因组稳定，对外源基因的容量较大，在基因转导中具有其独特的优势，如腺病毒载体和单纯疱症病毒载体等。将外源基因插入病毒基因组或是敲除特定病毒基因的方法是通过同源重组的方式完成，以腺病毒为例，第一代病毒载体是在真核细胞中进行同源重组和筛选，第二代病毒载体是在原核细胞中进行重组，虽然大大提高了重组效率，但是既需要在原核细胞、也需要在哺乳动物细胞中进行操作，工作相对复杂，产生出重组病毒往往需要数周的时间。

如果要在宿主细胞内对病毒进行定点改造，病毒基因组并不像细胞染色体在细胞核内占据相应的染色体领域，而是相对游离，其大小通常5K-200k bp，只是细胞基因组的百万分之一到万分之一，大部分病毒基因组均为线状（非环状），理论上理解，基因组一旦切断，就很容易断裂，从而导致病毒传代流产；并且病毒复制时间通常很短（复制周期约在12h-48之间）核酸酶系统的切断以及DNA基因组的修复过程在时间限制上也可能会严重影响病毒的产生，该方法的应用目前还未见相关研究报道。

综上所述，高效地对病毒基因组进行定点突变、定点基因敲除或提高外源基因插入病毒基因组的重组效率、以及简化重组的操作步骤，无论是对于DNA病毒疫苗株的筛选，DNA病毒载体的构建，还是溶瘤病毒载体的构建方面都具有显著的应用价值。

发明内容

针对现有技术诱导DNA病毒基因组定点突变困难，插入外源片段操作复杂，重组率较低的问题，本发明提供一种DNA病毒基因组的定点改造方法，能高效地对DNA病毒基因组进行定点改造，实现定点突变和特定基因敲除，定点插入外源基因、特定序列的大片段缺失及定点同源重组。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案： 

一种DNA病毒基因组的定点改造方法，是通过以下步骤实现的：

步骤一，构建定点切割的核酸酶系统：构建包含导向功能的分子和具有核酸酶活性的蛋白核酸酶系统；

步骤二，将步骤一的定点切割的核酸酶系统转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统的质量之间的比例为1×10⁵:0.25-2μg；

步骤三，将经步骤二处理后的细胞培养板的每个孔中加入病毒液，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞完全病变，得到病变细胞；

步骤四，收集步骤三得到的病变细胞和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液；

步骤五，从步骤四得到的子代病毒收获液中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出子代病毒；完成DNA病毒基因组的定点改造方法。

进一步的技术方案是，将上述步骤四得到的子代病毒，可通过任选嗜斑法或有限稀释法之一，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，获得改造后的目的重组病毒。其中，除了进行核酸测序检测以外，也可以通过抗性筛选、报告基因检测、蛋白丰度以及蛋白特异性检测等多种方法进行鉴定。

本发明中，具体地，步骤一中所述核酸酶系统可以是RNA导向的核酸酶（RNA-guided Nucleases, RGN）系统、锌指核酸酶（Zinc finger nucleases, ZFn）系统、转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）系统之一。其中，ZFn系统和TALEN系统的导向分子是蛋白，RGN是蛋白和RNA的复合物。