[发明专利]一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和分类学领域，特别涉及一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法。

背景技术

鲟鱼(sturgeon)隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、辐鳍亚纲(Actinopterygii)、硬鳞总目(Ganoidomorpha)、鲟形目(Acipenseriformes)，现在全世界共有2科6属27种。我国境内有2科3属8种，分别为施氏鲟(Acipenser schrenckii)、达氏鳇(Huso dauricus)、中华鲟(Acipenser sinensis)、达氏鳇(Acipenser dabryanus)、白鲟(Psephurus gladius)、西伯利亚鲟(Acipenser baerii)、小体鲟(Acipenser ruthenus)、裸腹鲟(Acipenser nudiventris)，鲟鱼是一类古老的软骨硬鳞鱼，有“活化石”之称。这些古老的鲟鱼类均处于不同程度的濒危状态，甚至有的有灭绝的危险。鲟鱼卵营养丰富，以其卵加工制成的鲟鱼籽酱，价格昂贵，是国际公认的奢侈食材，被比作“黑色黄金”。

目前国际上进行鲟鱼种类鉴定主要采用的方法包括形态学、生物化学和遗传学等方法。Congiu等使用AFLP分子标记方法进行了鲟鱼及鱼籽酱产品的鉴别应用，Chelomina等使用RAPD分子标记进行施氏鲟自然种群中杂交种鉴别分析。以线粒体为材料来研究鲟鱼类进化关系的研究报道相对也较多。主要集中在线粒体D-loop序列部分、细胞色素B、12s rRNA、16s rRNA等基因。对线粒体DNA控制区的研究发现，多个种的鲟鱼线粒体DNA均存在异质现象。近年来国内外常用线粒体DNA控制区序列以及微卫星DNA标记开展鲟鱼的分子鉴定。这些技术手段尽管能够不同程度的对鲟鱼和鲟鱼产品进行相对精确的鉴定，但是，也存在技术操作繁琐、鉴定时间长、设备昂贵等缺点，且对操作人员技术要求较高。

鉴于此，亟须开发出能够快速、准确检测出中华鲟与其他常见鲟鱼的分子检测技术，用于市场监管、种质鉴定等用途。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法。本发明运用了较少的试剂以及方便快捷容易操作的实验过程，可以在较短时间内，在不处死鱼种的基础上，只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的将中华鲟与其他常见鲟鱼种类区分开。

一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测用试剂盒，其特征在于，包括：引物对以及

引物对

PCR常规试剂：Taq DNA聚合酶、10×buffer PCR缓冲液、MgCl₂和dNTPs；

以及酶切试剂：10×buffer酶切缓冲液、100×BSA和Taqα1限制性内切酶。

优选的是，所述引物对为：

上游引物，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

下游引物，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列。

一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，使用权利要求2所述试剂盒用于常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法包括以下步骤：

步骤一，提取待检测样品的基因组DNA作为模板；

步骤二，将所述基因组DNA使用所述试剂盒包含的试剂和引物对配制成PCR体系，配制成的PCR体系放入PCR扩增仪中将进行PCR扩增，反应完成之后，将PCR产物放入4℃保存备用；

步骤三，用核酸内切酶酶切所述PCR产物，获得酶切产物；

步骤四，将所述PCR产物和所述酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图进行物种鉴定。

优选的是，所述PCR扩增反应的反应体系为15μl：即为在200μl PCR反应管中加入0.1μl浓度为2,500units/mL的Taq DNA聚合酶，1.5μl10×buffer PCR缓冲液，1.5μl浓度为10pm/μl的dNTPs，1.2μl25mM MgCl₂，2μl所述基因组DNA，0.5μl浓度为10pm/μl的所述上游引物，0.5μl浓度为10pm/μl的所述下游引物和7.7μl无菌水。