[发明专利]一种促进乙酸分泌的溶磷基因

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种促进乙酸分泌的溶磷基因。

背景技术

产生有机酸是溶磷微生物释放土壤难溶磷的一种主要的方式，有机酸与土壤中铁、铝、钙等离子螯合，从而使难溶磷转化为有效磷，提高磷肥利用率。溶磷微生物产生比较常见的有机酸有琥珀酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、富马酸和草酸。而溶磷微生物的应用受到如菌株的退化、作物种类、土壤特性、气候条件、溶磷菌与其它微生物间的交互作用等影响而效果不稳定。高效利用溶磷微生物产生有机酸或者通过异源表达克隆到的溶磷相关基因产生有机酸是提高土壤磷素利用率最有效的一种方式，而其关键是溶磷相关基因的获得。

关于溶磷相关基因研究以细菌为主，其主要机制是将葡萄糖直接氧化产生葡萄糖酸(GA)，其中葡萄糖酸的合成是由葡萄糖脱氢酶(GDH)和协同因子吡咯喹啉奎宁（PQQ）完成（Goldstein AH，1999，FEMS Microbiology Ecology,30(4):295-300.）。目前关于真菌溶磷相关基因的克隆也有报道，主要是以黑曲霉和草酸青霉为主，但其数量非常少，主要机制也不是很明确，也有报道从草酸青霉中克隆到的基因编码合成苹果酸脱氢酶在大肠杆菌中表达，分泌苹果酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、草酸等有机酸从而使难溶磷溶解（LüJ2011,Annals of Microbiology,1-8）。

目前，在ncbi数据库中发布了真菌Aspergillus niger CBS513.88（XM_001398218.2）和Aspergillus niger contig An17c0020（AM270384.1）的全基因组序列，与本发明序列同源性都为98%，但未对基因的功能进行预测与分析。与其他序列与本发明同源性较低，可能不为同一类。

在ncbi数据库中，Mikael R.Andersen等发布了Aspergillus niger ATCC1015的全基因组序列（2011，Genome Res.21(6):885–897.），与本发明基因编码的蛋白同源性为99%，对其功能也未进行预测。Futagami,T等报道从Aspergillus kawachii IFO4308克隆到的基因编码蛋白与本发明的蛋白同源性为99%，其为ubiquitin conjugating enzyme （泛素结合酶），但未报到其具有产生乙酸的功能。其它报道的都为假定蛋白，没有进行功能分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种溶磷基因，促进乙酸分泌，具有将难溶磷转化为有效磷提高磷肥利用率的效果。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种溶磷基因psa A，所述溶磷基因psa A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种由所述溶磷基因psa A编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了含有所述溶磷基因的载体。

作为优选，所述载体为表达载体pGEX-6P。

本发明还提供了含有所述溶磷基因的工程菌。

作为优选，所述工程菌为E.coli HST08。

本发明还提供了用于扩增溶磷基因psa A的开放阅读框序列的引物对，包括正向引物F：5'-TATTCGGAATTCATGTCTGCCAATCGAGCAAG-3'和反向引物R：5'-CAAGTACTCGAGCTACGGCTCGCCGAGGAGCCG-3'；

其中，溶磷基因psa A的开放阅读框序列为：

SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了溶磷基因psa A在促进乙酸分泌中的应用。

本发明从黑曲霉菌H1(Aspergillus niger H1)基因组中克隆获得，其氨基酸序列通过DNAMAN分析后获得。

具体地，本发明利用SMART技术构建黑曲霉H1的初级cDNA文库，通过难溶磷培养基筛选具有溶磷透明圈的转化子，对筛选出的转化子进行测序分析，获得其cDNA序列。利用软件DNAMAN对cDNA序列结构进行分析，获得其开放阅读框，其序列如序列表SEQ ID NO.3所示，根据序列，设计并合成上下游寡核苷酸引物，以筛选的转化子携带的质粒为模板，进行扩增，将开放阅读框部分序列连接到pGEX载体上，导入大肠杆菌，在大肠杆菌中表达，分泌乙酸。

本发明还提供了溶磷基因psa A在溶解无机难溶磷中的应用。