[发明专利]嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖中常见的致病病原菌——嗜水气单胞菌，特别涉及嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用。

背景技术

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）在自然界分布广泛，是多种水生动物的原发性致病菌，可产生多种致病因子，对水产动物，畜禽和人类均有致病性，可引起多种动物的败血症和人类腹泻，给人类健康带来了威胁，同时也给养殖业造成较大的经济损失（1.张翠娟，于宙亮，赵宝华，何宏轩．嗜水气单胞菌研究进展[J].中国兽医杂志，2008,42（7）：46-50.）。因此，对于作为水源污染指示菌的嗜水气单胞菌污染，其检测力度仍需进一步加强。目前嗜水气单胞菌的检测一直是个棘手的问题，传统的化学病理检测过程繁琐，耗费时间；酶联免疫、多重PCR技术则成本过高（2.王利．鱼类嗜水气单胞菌的几种检测方法[J]．内陆水产，2006,（2）：22-23．）。因此，开发一种操作简便，成本低廉，快速方便的嗜水气单胞菌检测方法，成为本领域技术人员迫切需要解决的技术难题。

SELEX( Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)即指数富集配体系统进化技术，是1990年由美国的Tuerk和Gold创建的一种体外合成筛选寡核苷酸适体的化学组合技术（3.孟庆玲，陈创夫．SELEX技术及其应用前景[J]．塔里木大学学报，2008，20(3):44-48． 4.廖世奇，刘巍，王黎．SELEX技术应用研究进展[J]．甘肃医药，2009，(02)：96-97．）。由于适体具有特异性高、库容量大、合成时间短（5.王聪艳，孙伟，李建国，等．SELEX技术应用研究进展[J]．生物技术通报 ，2006，(S1)：232-236．）等优点， SELEX技术现在广泛应用在疾病防控、药物筛选、临床诊断等不同的技术领域，随着技术的不断创新与发展，逐渐产生了一些新的SELEX筛选方法，如导向SELEX技术、复合靶分子SELEX技术、基因组SELEX技术等新的研究手段（6.孟庆玲，陈创夫．SELEX技术及其应用前景[J]．塔里木大学学报，2008，20(3):44-48．）。

发明内容

本发明的第一目的在于提供嗜水气单胞菌适体。

本发明的第二目的在于提供所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法。

本发明的第三目的在于提供所述嗜水气单胞菌适体在检测述嗜水气单胞菌中的应用。

所述嗜水气单胞菌适体的核酸序列如序列表中1-22号中的序列所示。

所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法是将指数富集配体系统进化技术（即SELEX 筛选）应用于嗜水气单胞菌适体的筛选，所述SELEX 筛选的具体步骤包括：

1）构建并合成待筛选的嗜水气单胞菌适体ssDNA文库，并设计合成相应的引物；

2）取适量所述ssDNA文库与嗜水气单胞菌进行结合；

3）分离获得与嗜水气单胞菌结合的ssDNA，以该ssDNA为模板进行PCT扩增，扩增产物再次进行SELEX 筛选直至获得相应适体。

在步骤1）中，所述ssDNA文库可为：：5′-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3′。

所述引物可为：

引物Ⅰ：5′-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3′；

引物Ⅱ：5′-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3′；

引物Ⅲ：5′-地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3′；

引物Ⅳ：5′-生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3′。

在步骤3）中，所述SELEX 筛选共进行12轮。

本发明采用SELEX技术筛选出致病性嗜水气单胞菌的高亲和力寡核苷酸适体，所述适体为嗜水气单胞菌的快速检测技术的开发以及在水产病害控制方面的应用提供参考，可广泛应用于嗜水气单胞菌的检测与分析。

附图说明

图1为 PCR产物3%琼脂糖凝胶电泳图。在图1中，M为50bp DNA marker，1、3、5、7、9、11、12分别表示第1、3、5、7、9、11、12轮的PCR产物。

图2为适体与嗜水气单胞菌结合的吸光度。在图2中，横坐标为筛选轮数，纵坐标为A450nm时的吸光度。