[发明专利]施马伦贝格病毒等温扩增快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检验技术，具体地说是运用环介导等温扩增法来检测施马伦贝格病毒。

背景技术

施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)与赤羽病病毒(Akabane disease virus)和加州脑炎病毒群(California encephalitis viruses)同属于布尼病毒科布尼病毒属，于2011年11月在德国北莱茵-威斯特法伦州施马伦贝格小镇被发现。该病毒能引起牛、绵羊和山羊的成年动物中度病症，表现为产奶量下降、发烧、腹泻等，引起流产及出生缺陷，目前施马伦贝格病已蔓延到德国、荷兰、比利时、英国、法国、卢森堡和意大利等欧洲国家，该病传播速度较快，对养殖业的危害巨大，已经引起了欧盟和世界动物卫生组织(OIE)的重视，因此快速、准确的检测家畜血清样品中是否含有施马伦贝格病毒将有助于控制施马伦贝格病毒的传播，并为我国的养殖业动物及其产品的正常贸易提供强有力的技术支持。

目前，施马伦贝格病毒的检测方法为中和试验及荧光定量RT-PCR。中和试验所需检测时间过长，费时费力；荧光定量RT-PCR对人员和设备要求较高，难于在基层实验室普及推广。

Notomi等开发了一种恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特点是在等温条件(65℃左右)下作用60min左右即可完成核酸扩增反应，更为重要的是此方法不需要贵重的仪器和试剂，在水浴锅中就能完成反应，特别适合在野外现场和基层部门应用。近年来，LAMP法已被成功地用于诊断发生于人类和动物的病毒性疾病，成为检测多种致病病毒的有效工具。我们建立了一种运用环介导等温扩增技术(LAMP)检测施马伦贝格病毒的方法，用于食品及原料、环境样本、医学样本及卫生防疫领域施马伦贝格病毒的检测。其技术方案是以施马伦贝格病毒基因组中编码S段区域基因序列为目的序列，设计特异性引物，优化反应体系，进行目的基因特异性扩增，本发明只需一个恒温装置，不需要模板的热变性、长时间温度循环，而且可以直接观察结果，具有低成本、高效率、操作简单的特点。

本发明建立的施马伦贝格病毒核酸LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点，可在基层或小型实验基地进行，为施马伦贝格病毒检测提供了一种新的技术与方法。

发明内容

为了提高食品检测效率，节约时间，以解决传统检测方法无法满足进出口货物日益增长的现状，本发明经过实验检测，终于探索出一种运用环介导等温扩增法检测施马伦贝格病毒的方法，该方法具有检测快速、便捷、低成本、适合在野外现场和基层部门应用等特点。

本发明的目的是提供了一种应用环介导等温扩增法检测施马伦贝格病毒的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一套检测施马伦贝格病毒的引物，其特征在于：通过环介导等温扩增技术检测施马伦贝格病毒的引物组，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，上述引物可以检测到至少10个拷贝的施马伦贝格病毒。

上述引物在制备用于检测施马伦贝格病毒的试剂盒中的应用。

一种用于检测施马伦贝格病毒的试剂盒，包括：

(1)环介导等温扩增反应试剂，包括扩增体系中的反应缓冲液和反应酶的组成；

(2)按照比例混合SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。

(3)阳性标本对照、阴性标本对照；

(4)使用说明书。

上述试剂盒中还包括SYBR Green I染料，加入到产物中可以在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。

利用上述试剂盒进行环介导等温扩增检测施马伦贝格病毒方法，包括：

(1)RNA的提取及cDNA的制备

取样本，将病毒灭活后，进行反转录反应，得到cDNA，-20℃备用；

(2)施马伦贝格病毒S段基因区的检测

2μL cDNA样品、5μL Bst DNA聚合酶缓冲液(10×)、2μL Bst DNA聚合酶(8000U/L)、5μL dNTP(10mmol/L)、3μL Betaine(5mol/L)、6μL Mg SO4(25mmol/L)、对应于S段基因的引物如权利要求1所述的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2各0.5μL、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4各4μL、18μL H2O，混匀；