[发明专利]抗三种有机磷农药的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗三种有机磷农药的单克隆抗体及其应用。 

背景技术

近20年来，随着农业生产的急速发展，有机磷农药的产量和使用量不断上升。大量使用，甚至不正当使用有机磷农药，使得有机磷农药残留问题日益突出。这不仅使环境安全，人们身体健康受有机磷农药威胁的概率增大，而且农药最高残留限量也成为世界各国针对中国农产品进出口的重要技术性贸易壁垒。因此，发展有机磷农药残留快速、简便、灵敏的检测方法对环境、食品安全，人们身体健康以及促进社会主义社会经济发展有着举足轻重的作用。 

目前，有机磷农药的残留检测多采用薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等方法。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。 

有机磷农药的免疫检测方法具有快速、廉价、简便、特异的优点，可便携而进行现场监测。克服了传统检测方法的缺点。通过化学合成有机磷农药的半抗原，与载体蛋白偶联获得完全抗原，制备针对环境和农产品中有机磷农药水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的单克隆抗体，建立上述三种有机磷农药免疫学检测方法。该方法的完成，将解决针对高毒有机磷农药水胺硫磷、甲基异柳磷、乙基异柳磷快速免疫检测方法中半抗原合成、人工抗原合成、单克隆抗体制备等关键技术，并建立上述三种农药的免疫快速检测体系。该专利不仅为食品安全检测，而且为我国农产品等的出入境检测，环境监测部门的水域监测提供了一种新的技术手段和检测方法。对我国农产品的可持续健康发展、解决食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。 

发明内容

本发明的目的是提供针现有技术的上述不足，提供一种抗三种有机磷农药的 单克隆抗体。 

本发明的另一目的是提供该单克隆抗体的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

分泌抗三种有机磷农药的单克隆抗体的杂交瘤细胞FQ-6E，于2013年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2013105，所述的三种有机磷农药为水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷。 

一种抗水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO：C2013105的杂交瘤细胞FQ-6E分泌。 

本发明所述的水胺硫磷等三种有机磷农药单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤： 

（1）针对水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的公共结构化学合成人工半抗原，合成路线如下： 

（2）人工抗原制备： 

采用活泼酯法将所述的人工半抗原分别偶联到载体蛋白牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA上，分别得到免疫原H1-BSA和包被原H1-OVA； 

（3）小鼠免疫： 

将制备好的H1-BSA作为免疫原免疫Balb/C鼠，鼠尾静脉采血用间接非竞争ELISA法检测血清抗体的特异性：以空白对照调零；以未经免疫小鼠血清作为阴 性对照，若待测孔OD450值大于或等于2.1倍阴性孔值定为阳性； 

（4）细胞融合： 

通过阳性值筛选Balb/C鼠，阳性值高的Balb/C鼠直接用H1-BSA免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞； 

（5）杂交瘤细胞筛选： 

用1000倍稀释的包被原H1-OVA包被酶标板，1%明胶封闭，取杂交瘤细胞的培养上清，采用非竞争间接ELISA法初步进行筛选，其中一抗为杂交瘤细胞上清，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以骨髓瘤细胞上清为阴性对照，选取呈阳性的细胞孔，细胞上清留存用于下一步检测，呈阴性的孔若重复一次后仍为阴性则可舍弃；对于上一步呈阳性的细胞孔则采用间接竞争ELISA法进行进一步的确认，对农药水胺硫磷出现明显的竞争性抑制反应的孔即为产生抗有机磷类农药水胺硫磷抗体的阳性杂交瘤细胞，送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2013105；保藏编号为CCTCC NO：C2013105的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，分泌的上清即为所制备的单克隆抗体。 

所述的人工半抗原优选通过以下方法制备： 

①O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯的合成