[发明专利]一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNase I活性的方法

权利要求书

1.一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNase I活性的方法，其特征在于工艺步骤为：

（一）检测探针的制备

（1）15nm粒径金纳米粒子AuNP₁合成

采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成15nm粒径金纳米粒子AuNP₁；

（2）25nm粒径金纳米粒子AuNP₂合成

采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成25nm粒径金纳米粒子AuNP₂；

（3）AuNP₁和DNA1偶联

步骤（1）合成出的AuNP₁和巯基修饰的DNA1进行偶联形成AuNP₁-DNA1复合体：取50mL 2nM的步骤（1）制备的AuNP₁加入20mg二水合双（对-璜酰苯基）苯基膦化二钾盐，震荡混匀，孵育12h后离心去除上清液，将沉淀以10 mL 0.5×TBE重悬；向其中加入DNA1，控制DNA1与AuNP₁的摩尔比为5:1，2h后，加入2M氯化钠使得氯化钠终浓度为50mM，12h后，离心，去除游离的DNA1分子，得到AuNP₁-DNA1复合体；

DNA1：HS-5’-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC-3’；

（4）AuNP₂分别和DNA2、DNA3、DNA4偶联

步骤（2）合成出的AuNP₂和巯基修饰的DNA2、DNA3、DNA4分别进行偶联形成AuNP₂-DNA2、AuNP₂-DNA3、AuNP₂-DNA4复合体，偶联步骤与步骤（3）相同；

DNA2：HS-5’-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’；

DNA3：HS-5’-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’；

DNA4：HS-5’-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’；

（5）AuNP₁与AuNP₂组装形成具有手性的金四面体结构

分别取步骤（4）制备出的1mL 2nM的AuNP₂-DNA2、AuNP₂-DNA3、AuNP₂-DNA4复合体和步骤（3）制备出的1mL 2nM的AuNP₁-DNA1复合体混匀进行杂交，杂交缓冲液：1×TBE，杂交时间24h，形成具有手性的金四面体结构；对该金四面体结构进行透射电镜表征与圆二光谱表征；

（二）圆二光谱CD检测，建立CD信号强度与DNase I活性之间的标准曲线

向步骤（5）制备的手性金四面体溶液1mL, 2nM中加入一系列不同活性浓度的DNase I：分别为0U/mL、0.005U/mL、0.01U/mL、0.05U/mL、0.1 U/mL、0.2 U/mL、0.5 U/mL、1U/mL、10 U/mL；37℃下反应10 min后，测定CD信号，以DNase I活性为横坐标，CD信号强度为纵坐标，建立标准曲线。