[发明专利]通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程方法提高酶活力技术领域，特别是涉及通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法。 

背景技术

蛋白酶（peptidase, proteases, proteinases或proteolytic enzymes）是一类可催化蛋白质或肽类肽键水解的酶类。

弹性蛋白（elastin）在动物组织中广泛存在，如富有弹性的组织、肺、大动脉、某些韧带、皮肤及耳部软骨等。弹性蛋白由多条弹性蛋白原（tropoelastin）多肽链以共价交联方式连接而成（Yeo et al., 2011），具有非常稳定的结构，而且不含常见蛋白酶识别的氨基酸和酶切位点，使得弹性蛋白只能被弹性蛋白酶分解。能够水解弹性蛋白的蛋白酶称为弹性蛋白酶（elastase）。

按照来源分，弹性蛋白酶可分为微生物弹性蛋白酶和动物弹性蛋白酶。其中，哺乳动物弹性蛋白酶主要存在于动物的胰腺和吞噬细胞中（Horwitz et al., 1999; Mason et al., 1986; Bode et al., 1989; Antonicelli et al., 2007）。研究比较多的细菌来源的弹性蛋白酶有金属蛋白酶M4家族的PAE/pseudolysin (Morihara and Homma,1985)和vibriolysin（Lutfullah et al., 2008）、M9家族的MAP1 peptidase(Dumont et al., 1994)、M12家族的myroilysin(Chen et al., 2009a)、M23家族的staphylolysin（Kessler and Ohman, 2004b）和丝氨酸蛋白酶S8家族的A1p1（Behnsen et al., 2010）等。

弹性蛋白酶在医学、食品学和日用化学上有着广泛应用。在医药方面主要作为治疗药物：（1）治疗高脂血症，（2）防治动脉粥样硬化，（3）抑制脂肪肝发展，（4）治疗慢性气管炎及其它结缔组织纤维增生性疾病，（5）外用于消除皮肤焦痂、碎屑，用于烧伤患者的治疗以及皮肤溃疡、口腔溃疡等症。在食品工业方面常用于对动物难以处理和食用的韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白质废料进行加工。日用化学工业方面，弹性蛋白酶主要用于疗效化妆品的生产。

PAE （Pseudomonas aeruginosa Elastase, pseudolysin）是革兰氏阴性机会致病菌铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）分泌的一种胞外弹性蛋白酶，可以降解酪蛋白、血红蛋白、卵清蛋白、纤维蛋白等。在底物特异性方面，PAE倾向降解P1’位为疏水或芳香族氨基酸的肽键（Morihara 1995; Morihara et al., 1965）。目前，已经商品化的PA来源的PAE售价昂贵，EPC公司（Elastin Products Company Inc.）每0.1 mg PAE售价183美元（PE961，https://www.elastin.com/storefront/tabid/58/c/Metalloproteinases/CategoryID/19/Default.aspx），Merck公司每0.1mg PAE售价4500元人民币（324676-100UG，http://www.millipore.com/catalogue/item/324676-100ug）。PAE能够在原核细胞和真核细胞中异源表达并且重组酶有酶活（Ogino,H. et al., 2000; Lin et al., 2009）。我们前期研究表明将构建好的含lasB基因的表达载体转化至E.coli BL21(DE3)中， 1 L培养物细胞经超声破碎和柱层析纯化后，可获得纯酶4.5 mg，总酶活285984个酶活单位（酶活力定义为60 ??C，每分钟催化酪蛋白水解生成1 μg 酪氨酸的酶量为1个单位U）（Xie et al., 2009）。