[发明专利]ELISA检测融合蛋白rMBP‑NAP的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白rMBP-NAP，尤其涉及一种ELISA检测融合蛋白rMBP-NAP的方法。

背景技术

    幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是定植于人胃粘膜的革兰氏阴性螺杆菌，世界上约有50％的人感染幽门螺杆菌。幽门螺杆菌产生一系列独特的毒力因子，其中包括中性粒细胞激活蛋白(Hp-NAP)。Hp菌体培养条件苛刻，难以进行大规模培养。细菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐。本实验室在中国第一个提交了HP-NAP的编码基因序列，Gnebank登录号AY366361，并构建了由大肠杆菌E. coli TB1表达重组蛋白rMBP-NAP的方法，rMBP-NAP蛋白的分子量约为 59KD，为大分子蛋白抗原，该蛋白由MBP（麦芽糖结合蛋白）和NAP（幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白）两种蛋白融合而成，具体制备方法见专利CN201010177875.0。

    Enzyme-linkedimmunoassay，简称ELISA，是利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测，主要以夹心法(sandwich)、间接法(indirect)、以及竞争法(Competitive)三种为主。

    其中双抗体夹心法基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体抗原酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法。

    双抗体夹心法中，传统的双多抗夹心法(A法)所需检测抗体和固相载体包被抗体都是多抗，制备简单，在一定范围内检测灵敏度高，信号显示强，很难避免钩状效应，其主要问题在于：固相载体上的抗体和检测抗体都为针对完整抗原所有抗原结合位点多克隆抗体，抗原浓度比较低的时候，固相支持物上的抗体几乎跟抗原上所有位点结合，结合力强，空余位点少，检测抗体与抗原位点少，结合力弱，只要固相支持物上的抗体未与抗原结合饱和，抗原量与最后信号显示部呈线性关系；随着抗原量的增加，固相支持物上的抗体与抗原结合饱和，空余位点越来越多，检测抗体与抗原的空余位点结合，信号显示与实际抗原增长呈几何倍数增长，同样不呈线性关系；随着抗原量的增加，固相载体上的抗体与每个抗原的结合位点很少，结合力很弱，而过量的检测抗体与其结合位点增多，结合力增强，因为抗原抗体结合本来就是一个动态可逆的反应过程，一旦从固相载体上抗体与抗原解离下来的时候，位点立即被检测抗体结合，形成抗原抗体复合物沉淀，在洗涤过程中被洗掉，随着抗原量的增加，而信号反而降低，就是所谓的钩状效应。此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。

而用高亲和力的单克隆抗体对(B法)即检测抗体和固相载体包被抗体都用单克隆抗体，生产此类试剂盒可削弱钩状效应，由于固相载体上的抗体和检测抗体结合的不是相同的位点，所以不形成竞争关系，一般情况下不会形成钩状效应，但是单克隆抗体制备周期长，成本高，特别是高亲和力的配对抗体更是不容易得到，同时，由于固相载体上抗体和检测抗体都是单位点与抗原结合，所以结合力弱，信号显示值低，敏感性差，稳定性也不好。

发明内容

    本发明克服了现有技术的不足，提供了一种ELISA检测融合蛋白rMBP-NAP的方法,制备方法简单、成本低、周期短，且精密度、特异性好。

    为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

    一种ELISA检测融合蛋白rMBP-NAP的方法，包括以下步骤：

1）包被：将100ul被包被缓冲液稀释至500ng/mL的兔抗幽门螺杆菌NAP多抗，包被至固体载体如酶标板，用洗涤缓冲液洗涤；  

2）封闭：再加封闭液以封闭，孵育后洗涤

3）加样：分别加入100ul工作浓度（15.625-1000ng/mL、2倍倍比稀释的梯度）的rMBP-NAP抗原标准品和待测样品，孵育后洗涤