[发明专利]一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法。

(二)背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是普遍存在于生物体内的一种能清除超氧阴离子自由基的金属酶，具有抗炎症、抗辐射、抗肿瘤等多种功能，现已被广泛应用于医药、食品、保健食品和化妆品中。

目前从动物血液中提取超氧化物歧化酶的工艺流程主要是血液抗凝——用生理盐水洗涤——低温溶血——氯仿乙醇抽提血红蛋白——磷酸钾萃取——热变性——丙酮沉淀——离子交换层析——分子筛柱层析。该工艺缺点是流程复杂，成本高昂，且氯仿、丙酮等有机溶剂具有较强的毒性，对环境具有严重污染，对操作人员身体亦造成不可估量的损害。

(三)发明内容

为了克服现有从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法的上述不足，本发明提供一种工艺简单，成本低廉，不使用任何有机溶剂，对环保和操作人员身体健康有利的从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法。

本发明解决其技术问题的技术方案是：一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤：

A.血液分离：取动物新鲜血液，加入质量浓度为5～13％的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的5～10％，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应罐；

B.溶血破碎细胞：向步骤A收集的红细胞中加入1～3倍体积的纯净水，使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；

C.热变性：将红细胞溶血液加热至60℃保温10～30分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的碱金属盐，至碱金属盐浓度为0.1～0.6mol/L，继续加热至65℃，保温20～60分钟后，再升温至70～75℃，保温15至20分钟，立即放料冷却；

D.压滤：用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液；

E.超滤浓缩：SOD粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的2％～12％，即为SOD浓缩液；

F.沉淀除杂蛋白：向步骤E所得的SOD浓缩液中加入金属盐，至该金属盐浓度为1～5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品。

优选的，在步骤F中，获得的SOD粗品经离子交换层析后再经分子筛层析后获得SOD精品。

优选的，在步骤C中，所述的碱金属盐为碱金属的氯化物中的一种或几种的混合物。

优选的，在步骤F中，所述的金属盐为铜盐或锌盐中的一种或几种的混合物。

优选的，在步骤B中采用高压匀浆使红细胞完全破碎或采用搅拌机搅拌使红细胞完全破碎。

优选的，离子交换层析是DEAE阴离子交换层析，所用的层析填充料为DEAE-Sepharose FF。

优选的，分子筛层析填充料是Sephadex G-100或Sephadex G-75，层析柱先用纯净水平衡，然后上样，以纯净水洗脱，收集SOD活力峰。

本发明的有益效果在于：本发明彻底摒弃了氯仿、乙醇和丙酮等有机溶剂，根据SOD分子的结构特点及理化性质，采用热变性和金属盐沉淀的方法，简便的分离出具有较高活力的粗品SOD，这是对SOD生产的是革命性的改进。由于不使用任何有机溶剂，所以该方法成本低廉，更适合于工业化生产。本发明由于采用热变性除血红蛋白，因此可以在常温下溶血，使操作更简便，降低能耗。

本发明在热变性中60℃保温10～30分钟后，再向红细胞溶血液中加入NaCl、KCl等碱金属盐以增加溶液离子强度，使得热变性更彻底，杂蛋白去除更完全，同时最大限度的保持原有的SOD活力，得率比传统的氯仿乙醇法更高。碱金属盐在热变性对SOD有保护作用，碱金属盐的加入，增加了红细胞溶血液的离子强度，适当的离子强度可以抑制变性的血红蛋白沉淀吸附SOD，使SOD抽提更完全，同时高盐浓度对SOD有一定的保护作用，上述两大优势提高了SOD的得率。

本发明改进了原有的丙酮一次沉淀或分级沉淀的方法，因丙酮沸点低，容易挥发，在操作过程中对操作人员身体健康有严重影响，同时回收过程中损失大，成本高，对生产环境污染严重。在生产工艺中，尽可能不使用有机溶剂。我们替代的是金属盐沉淀杂蛋白，这样，即降低了生产成本，有利环保和操作人员身体健康，又提高了SOD的活性。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例一