[发明专利]一种用电感耦合等离子体质谱法检测乙肝表面抗原的方法

说明书

技术领域

本发明属于质谱分析领域，具体涉及一种用电感耦合等离子体质谱法检测乙肝表面抗原的方法。

背景技术

中国是乙型病毒肝炎的高发国家。根据流行病学调查，人群发生率较高，表面抗原携带率约为15%。乙肝病毒的实验诊断对于其治疗及预防有重要的参考意义。乙肝表面抗原（HBsAg）是HBV感染后第一个出现的血清学标志物, 也是诊断的重要指标之一。出于检测成本等原因，国内大多数临床实验室都采用酶联免疫吸附法（ELISA）来检测HBsAg。但对于HBsAg浓度较低的标本，检测时常因方法学的原因造成灵敏度较低，检测范围窄，导致临床出现漏检，给病人带来损失，尤其是需要临床输血的病人。而其它如放射免疫法、化学发光免疫法以及荧光免疫法等方法虽然具有灵敏度高、线性范围宽等特点，但因其具有辐射危害、对标记物的选择有限等而限制了其更广泛的应用。

电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）是20 世纪80年代发展起来的多元素分析手段，具有灵敏度高、检出限低、选择性好、线性动态范围宽、能够进行多元素同时测定和同位素比测定等优点；将其与多种分离技术及进样方法相结合，可以用于复杂体系的痕量或超痕量元素分析。随着ICP-MS技术的日趋成熟，应用领域也在不断拓宽。而纳米粒子的生物标记研究为ICP-MS在免疫分析上的应用带来了一次革命性的发展。由于纳米生物探针中的各种无机金属纳米离子均可以通过ICP-MS测定，因此，ICP-MS有可能成为一种简单、高灵敏度、成本低廉的纳米离子生物探针的新检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种用电感耦合等离子体质谱法检测乙肝表面抗原的方法，该方法具有较高的准确性和灵敏度，免疫分析检测方便、迅速，可用于临床分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用电感耦合等离子体质谱法检测乙肝表面抗原的方法，其包括下述步骤：

1）制备带有活化羧基官能团的金属胶体溶液：用浓度为0.01 mol/L、pH值为7.2―7.6的磷酸盐缓冲液（PBS）分别溶解1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，配制成浓度均为20 mg/mL的溶液，然后将其与金属胶体溶液按摩尔比n_EDC：n_NHS：n_金属胶体＝5：7.5：1混和，于4℃振荡30 min使羧基活化形成活泼酯，再经高速离心分离使金属纳米颗粒沉降，弃去上清液，得到活化后的金属胶体溶液；

2）纳米胶体溶液标记乙肝表面抗体（HBsAb）b：将步骤1）所得活化后的金属胶体溶液的pH调至6.2（可选用0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节pH），加入HBsAb于4℃恒温震荡1h（使抗体与羧基活化的胶体溶液充分接触，发生共价偶联反应），再逐滴加入牛血清蛋白（BSA）使其终浓度为1％（质量百分比）；然后于4℃、2000转/分离心30min（用以弃去大粒子沉淀），取上清夜50000转/分4℃离心60 min，弃去上清夜中未结合的蛋白质，取沉淀用含1％BSA的磷酸盐缓冲液（PBS, 0.01mol/L、pH＝7.4，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾配置而成）溶解，重复离心2次，将沉淀悬浮于PBS中（0.01mol/L、pH＝7.4），再加入叠氮化钠(NaN₃)、BSA使其终浓度分别为0.04％和1％（质量百分比），所得溶液即为纳米金属颗粒标记的抗体溶液，于4℃放置备用；

3）构建免疫过程：将含不同浓度HBsAg的碳酸盐缓冲溶液（缓冲液浓度0.01 mol/L、pH 9.6，由碳酸钠和碳酸氢钠配制而成）加入到各聚乙烯板的孔中，4℃放置过夜（12h）；用洗涤缓冲液洗涤聚乙烯板的各孔；每孔加入含1％BSA的PBS（0.01 mol/L，pH＝7.4），37℃温育反应1 h（用以封闭活性位点）；然后加入步骤2）所得纳米金属颗粒标记的抗体溶液于37℃反应2 h（用以通过免疫反应生成免疫复合物）；最后用洗涤缓冲液充分洗涤聚乙烯板的各孔；

4）金属离子信号检测：在聚乙烯板的各孔中加入2％（体积百分比）的硝酸溶液，超声15 min（用以使纳米金属颗粒从免疫复合物中解离下来），然后用蠕动泵将样品带入ICP-MS，测定金属离子信号；

5）根据金属离子在ICP-MS中的强度与HBsAg的浓度呈线性关系，绘制工作曲线。