[发明专利]逃避预存免疫的重组腺病毒及其构建方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，涉及一种用于基因治疗和疫苗载体重组腺病毒及其构建方法和应用。

背景技术

重组腺病毒(recombinant adenovirus，rAd)以携带外源基因片段大、滴度高、易于操作、不会整合到宿主基因组等优点成为一种良好的基因治疗和疫苗载体。目前，已知的人腺病毒（Ad）有57种血清型，分为7个亚属(A-G)，已经在基因治疗和疫苗载体方面得到了很多的应用，特别是C亚属的血清2和5型（Ad2和Ad5）已被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。目前，应用最广的腺病毒载体(adenovirus vector,Adv)是人血清5型腺病毒，它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。

例如，在基因治疗的应用方面：2003年10月我国国家食品药品监督管理局（SFDA）正式批准了世界第一个抗肿瘤基因治疗药物——重组人P53腺病毒注射液（深圳赛百诺基因公司）上市，随后在2005年11月，SFDA又批准了全球首个溶瘤病毒类新药——重组人5型腺病毒注射液（上海三维生物技术有限公司）上市。而在疫苗载体的研究方面：重组5型腺病毒(rAd5)的强免疫原性也已被大量的临床前研究所证实。Shiver和Emini（默克公司）等人在以重组腺病毒类，痘病毒类，甲病毒类，分支杆菌以及质粒DNA疫苗均表达猴免疫缺陷病毒(SIV)Gag抗原的一些免疫原性比较实验中，重组5型腺病毒载体引发了最强抗原特异的CTL反应(Shiver and Emini,2004;Shiver et al.,2002)。因此艾滋病疫苗的大规模临床研究就使用了rAd5载体（WO01/02607，WO02/22080）。

然而，重组5型腺病毒(rAd5)应用中的一个主要问题是人体针对载体本身存在十分普遍的预存免疫，人体内较高的针对Ad5的抗体水平会显著地降低病毒载体的转导效率和转基因表达水平。例如，艾滋病疫苗的临床研究显示：预存免疫的存在使得rAd5疫苗在小鼠、恒河猴以及人体内的免疫原性都显著地下降。而且，Ad5特异中和抗体在人体内的广泛存在还有可能导致不相容的和难以预知的免疫反应和毒性(Barouch and Nabel,2005)，这就严重限制了重组腺病毒载体的应用。然而，相关的调查却显示：目前西方国家Ad5的血清阳性率已经接近70％，而在非洲的撒哈拉和东南亚的部分地区有报道显示Ad5的血清阳性率甚至高于90％。除了预存免疫问题，rAd5可以说是一种几乎完美的基因治疗和疫苗载体。

目前尝试解决Ad5预存免疫问题的策略主要有以下几种：①利用新方法来运载rAd5载体；②从其它人体腺病毒血清型甚至其它动物种属中开发新的重组腺病毒载体；③对rAd5载体进行基因工程改造，这一方法与其他方法相比更安全也更具有应用性。该法方具体是以源于人体安全性较好的人体稀有血清型腺病毒如Ad35、Ad11、Ad26、Ad48以及Ad49等的抗原决定簇基因来替换rAd5载体的相应基因以希望获得既保留rAd5载体的免疫原性，又带有稀有腺病毒亚型血清学性质的嵌合型载体（WO2006/040330）。Dan H.Barouch等以替换了人腺病毒血清48型全部7个HVR的rAd5载体表达SIV的结构蛋白Gag基因。小鼠和猴子体内试验显示，在较高水平针对rAd5的预存免疫条件下，Gag的表达不被明显抑制，其相关试验也说明腺病毒中和抗体主要针对六邻体HVR。然而该载体的包装效率以及免疫小鼠产生针对Gag抗体滴度仅约为rAd5的1/3(Roberts et al.,2006)。