[发明专利]用于检测六价钼离子的酶联免疫试剂盒及其组建和检测方法

权利要求书

1.一种用于检测六价钼离子的间接竞争酶联免疫试剂盒，包括盒体，其特征在于：盒体内设有用六价钼离子包被抗原包被过的酶标板、抗六价钼离子单克隆抗体抗、酶标二抗、底物显色液、终止液、六价钼离子标准溶液、洗液浓缩液、样品处理液。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征是：所述六价钼离子包被抗原是由以下方法制备的：

取20 mL钼酸与1mL浓度为10 mmol/L pH值为8.0的HEPES缓冲液混合，得到Mo⁶⁺溶液；称取10 mg 异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1mL 二甲基亚砜中，形成金属螯合剂溶液；将Mo⁶⁺溶液和金属螯合剂溶液混合，调节溶液的pH值至7.4，25℃搅拌24h，转速为1000 r/min，形成Mo⁶⁺-ITCBE螯合物的半抗原母液；称取20 mg 载体蛋白OVA溶于1mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；取1mL Mo⁶⁺-ITCBE螯合物半抗原母液，加入到1mL载体蛋白溶液中，调节pH值至9.0，室温下1000 r/min搅拌24 h，然后移入透析袋中透析7 d天，收集透析液，制备出包被抗原Mo⁶⁺-ITCBE-OVA，－20℃冻存备用。

3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标板按如下方法进行包被：包被抗原为Mo⁶⁺-ITCBE-OVA，包被浓度为2 μg/mL，包被溶液为0.05 moL/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液，包被剂量为100 μL/孔，37℃温育2 h或室温8 h，用洗液PBST洗涤3次，用5%的猪血清封闭，每孔250 μL，37℃温育1 h，用洗液PBST洗涤3次；所述洗液PBST为0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含0.05%的Tween-20。

4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的抗六价钼离子单克隆抗体是按以下方法制备的：

制备免疫抗原：取20 mL钼酸与1mL浓度为10 mmol/L pH值为8.0的HEPES缓冲液混合，得到Mo⁶⁺溶液；称取10 mg 异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1mL 二甲基亚砜中，形成金属螯合剂溶液；将Mo⁶⁺溶液和金属螯合剂溶液混合，调节溶液的pH值至7.4，25 ℃搅拌24 h，转速为1000 r/min，形成Mo⁶⁺-ITCBE螯合物的半抗原母液；称取20 mg 载体蛋白BSA溶于1mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；取1mL Mo⁶⁺-ITCBE螯合物半抗原母液，加入到1mL载体蛋白溶液中，调节pH值至9.0，室温下1000 r/min搅拌24 h，然后移入透析袋中透析7 d，收集透析液，制备出免疫抗原Mo⁶⁺-ITCBE-BSA，－20℃冻存备用；

免疫动物：以Mo⁶⁺-ITCBE-BSA为免疫抗原，以Balb/c小鼠作为免疫动物，背部皮下多点注射，免疫剂量为每只每次50～100 μg，首免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫，共免疫5次；

选择细胞融合备用小鼠：间接ELISA法检测抗血清中Mo⁶⁺螯合物多克隆抗体的效价，阻断ELISA法检测Mo⁶⁺螯合物多克隆抗体对Mo⁶⁺-EDTA的半数抑制浓度IC₅₀，挑选效价最高、IC₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合；

制备阳性杂交瘤细胞：取NS0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞用PEG进行细胞融合，经过四次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗六价钼离子的单克隆抗体的细胞株；

制备单克隆抗体：对经产母鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，采集腹水纯化，获得抗六价钼离子的单克隆抗体。