[发明专利]一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生化技术领域，涉及一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，具体地说是一种基于环介导等温扩增技术的鼠伤寒沙门氏菌的检测方法。

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是常见的沙门氏菌致病的血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热，对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，形成了哥本哈根变种、宾斯变种及O型变种三个变种。

传统鉴定鼠伤寒沙门氏菌方法主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等经典方法，但经典方法有操作繁琐、耗时长、检出率低等缺陷，对该病的准确检测和及时治疗十分不利。针对鼠伤寒沙门氏菌的酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、免疫组化及免疫荧光等检测技术也有报道，但也不同程度地存在某些缺点。至上世纪80年代末聚合酶链反应技术诞生，极大的推动了分子生物学技术的发展，并促进了病原微生物核酸水平检测技术的发展，成为最重要的检测手段之一。但PCR技术需要复杂的温度变化、长时间的温度循环、繁琐的电泳检测，而荧光定量PCR技术需要昂贵的仪器以及繁琐的操作过程，使得该技术在基层实验室以及检疫机构推广使用受到了局限。

21世纪初，Notomi T等几位日本学者开发了一种新型的恒温扩增技术，即环介导恒温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。其原理为采用能够特异生识别靶序列上8个区域设计的6个特异引物，利用一种具有链置换性Bst-DNA聚合酶在恒温条件(60℃-65℃)下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。其扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝数的数量级，并且可以通过扩增副产物焦凝酸镁沉淀产生的浊度或者显色反应进行判断反应发生与否。

LAMP技术与PCR技术相比具有相同甚至更高的灵敏度，且具有操作简便、花费低等优点。该技术使得整个检测过程在恒温水浴锅中即可完成，大幅降低了仪器成本，并且适用于大量样本同时检测。

经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测方法、核酸及引物有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，该方法是一种鼠伤寒沙门氏菌的快速检测试剂盒的制备和检测方法，为食品及公共卫生安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的主要原理为：选取鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因序列如SEQ ID NO：1所示，特异性强保守性高的区域，利用PrimerExplorer V软件进行分析，设计可以特异性识别靶基因6个不同序列的引物：两个内引物(上游内引物和下游内引物)、两个外引物(上游外引物和下游外引物)和两个环游引物(上游环引物和下游环引物)，而且内引物包含靶DNA的正义链和反义链。通过LAMP反应，在等温条件下，在45分钟内，在内外引物的作用下，可使靶DNA累积到10¹¹拷贝，可通过荧光染料等方法来观察扩增结果。

1鼠伤寒沙门氏菌基因的环介导等温扩增引物情况

表1：针对编码鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因的LAMP反应引物序列组成

引物类别序列组成

F3    外引物          5'-GCATTTATCCAGCCCGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)

B3    外引物          5'-AACAAGACATCGGGATCCAG-3’(SEQ ID NO：3)