[发明专利]一种高抗草甘膦EPSP合酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及一种微生物来源的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase，EPSP合酶）、其编码基因以及其在培育抗草甘膦植物中的应用。

背景技术

草甘膦（glyphosate），是20世纪70年代初期，由美国孟山都公司的John E Franz最先发现合成。草甘膦具有高效、低毒、在环境中降解快、广谱灭生等优良特性，且制备工艺简单。由于草甘膦种种突出的特性，使其在几十年间迅速发展成为当今农业生产中生产量及销量最大，使用面积最广的一种除草剂。

草甘膦的作用机理主要是竞争性地抑制莽草酸途径中的催化PEP和S3P生成EPSP的EPSPS。草甘膦是PEP的结构类似物，其作为EPSPS的抑制因子，可以占据EPSPS与底物结合的活性位点导致莽草酸途径的受阻，进而使植物体内莽草酸大量积累，最终使植物产生草甘膦毒害(Steinrucken,H.C.,and Amrhein,N.(1980).The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of5-enolpyruvyl-shikimic acid-3-phosphate synthase.Biochem Biophys Res Commun94,1207-1212)。

莽草酸途径只在植物和微生物中发现，尚未在哺乳动物中发现此途径存在的报道，莽草酸是很多化合物合成的前体，因此成为很多抗菌剂、活性移苗和除草剂的重要靶标。EPSPS作用于莽草酸途径中的第六步酶反应，是植物、微生物合成芳香族氨基酸及相关芳香族代谢物必不可少的关键酶。EPSPS由aroA基因编码，催化底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和莽草酸-3-磷酸（S3P）生成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP），在此过程中释放出1分子无机磷（Pi）。EPSPS在催化底物的过程中，首先与S3P结合成二元复合物，之后再通过切割C-O键与PEP相结合形成三元复合物，最终生成EPSP，介导莽草酸途径的正常进行（Boocock,M.R.,and Coggins,J.R.(1983).Kinetics of5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase inhibition by glyphosate.FEBS Lett154,127-133）。

EPSPS是广谱性除草剂草甘膦的作用靶标，草甘膦可以和EPSPS的底物PEP竞争性地抑制EPSPS的活性，导致植物莽草酸途径的受阻，使植物生长受到抑制甚至是死亡。来源于植物中的EPSPS编码基因，一般都不具有草甘膦抗性，低剂量的草甘膦就可以严重抑制EPSPS的酶活性（Funke,T.,Yang,Y.,Han,H.,et al.(2009).Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97->Ile and Pro101->Ser in5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli.J Biol Chem284,9854-9860）。

为了增加植物EPSPS的草甘膦抗性能力，一般通过两种途径，可以增加其与底物PEP和S3P的亲和能力，或者增加对草甘膦的抑制常数。但由于PEP与草甘膦在结构上的高度相似，往往在增加EPSPS与PEP亲和能力的同时，对草甘膦的抑制常数也下降；另一方面，EPSPS对草甘膦结合能力下降的同时往往也伴随着对PEP亲和能力的下降（Zhou,M.,Xu,H.,Wei,X.,et al.(2006).Identification of a glyphosate-resistant mutant of rice5-enolpyruvylshikimate3-phosphate synthase using a directed evolution strategy.Plant Physiol140,184-195）。