[发明专利]枯草芽孢杆菌PCR检测、鉴定特异引物对

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体而言，提供了利用PCR技术快速检测、鉴定枯草芽孢杆菌的引物对，适合于微生物肥料质检机构、菌种鉴定机构应用。

背景技术

随着农业的可持续发展和社会主义新农村建设力度的加大，微生物肥料在培肥地力、提高化肥利用率、修复土壤、促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用、提高农产品品质等方面的作用受到更多的重视。近三十年我国微生物肥料行业发展迅速，产品种类不断增加，而产品的核心-特定的微生物已达100多种。种类繁多的菌种拓展了微生物肥料的应用范围，提高了作用效果，同时也给微生物肥料产品的质量监督和检验带来了新的考验。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是微生物肥料中最常使用的菌种，与地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、、深褐(萎缩)芽孢杆菌(B.atrophaeus)、莫哈韦(莫杰夫)芽孢杆菌(B.mojavensis)、死谷芽孢杆菌(B.vallismortis)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)、暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)等芽孢杆菌同属枯草群。枯草群菌株表型相似，很难快速准确区分，而传统的检测方法主要是以形态特征和生理生化特征为主，存在着检验周期长，操作繁琐，费用高，准确性差等缺点。因此，迫切需要研究建立快速、准确、灵敏的检测新方法，以满足以枯草芽孢杆菌为有效菌的微生物肥料产品检测的准确性和时效性。

PCR方法有着快速、准确和灵敏的特点，已广泛用于食品安全、临床医学等领域：如对各种病毒和病源体-乙肝病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病源菌已建立了PCR检测方法；在微生物肥料领域也得到了应用，关大伟等人曾建立了的特异PCR法用于沼泽红假单胞菌的鉴定和检测，曹凤明等人建立了一种鉴定微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌的特异PCR方法，都取得了良好的应用效果。这都表明了随着技术的发展，分子生物学技术将在微生物检测领域发挥着越来越重要的作用。为将PCR技术更广泛应用于微生物肥料检测和菌种鉴定领域，本发明人利用NCBI中Primer5.0(引物设计工具)，以Genbank数据库中某个枯草芽孢杆菌的gyrA基因(解旋酶基因)为目标模板序列设计出一对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)种特异性引物。并通过反复摸索实践建立了基于PCR技术的、能够快速、准确、灵敏地检测微生物肥料中枯草芽孢杆菌的方法。该方法适用于枯草芽孢杆菌的检测和鉴定。

发明内容

本发明内容的关键是提供用于检测、鉴定枯草芽孢杆菌的特异引物对。另一内容是提供利用这对引物对待测菌株进行特异PCR扩增鉴定枯草芽孢杆菌的方法。

具体而言，本发明利用已公布的枯草芽孢杆菌gyrA基因核酸序列为目标模板序列，利用Primer5.0(引物设计工具)设计枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)种特异性引物，然后在Genbank数据库中考察引物的特异性，再通过优化PCR反应中的镁离子浓度和退火温度等条件来提高PCR方法的特异性，并根据优化结果建立了枯草芽孢杆菌的特异PCR鉴定方法，用于微生物肥料中枯草芽孢杆菌的检测和鉴定。

本发明用于检测、鉴定枯草芽孢杆菌的引物对序列为：

上游引物(F)：5′-TCTGCTCGTGAACGGTGCT-3′；

下游引物(R)：5′-TTTCGCCTTATTTACTTGG-3′。

本发明用于鉴定枯草芽孢杆菌的PCR方法为：

PCR反应体系：

PCR扩增参数：

附图说明

图为应用枯草芽孢杆菌特异引物对标准菌株进行PCR的实验结果(照片)如所示。其中，各泳道的具体说明如下：

泳道1：标准分子量：100bp标准分子量

泳道2：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CCTCCAB92068)

泳道3：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CGMCC1.1849)

泳道4：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis JCM2499)

泳道5：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ACCC10242)

泳道6：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC29056)

泳道7：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ACCC11025)