[发明专利]一种无动物来源成分的细胞培养用微载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生化工程和动物细胞工程领域，具体涉及一种动物细胞培养用微载体，特别涉及一种无动物来源成分的含有氨基酸或者多肽配给以及细胞粘附因子的微载体以及其制备方法和其用于细胞培养的方法。

背景技术

微载体培养技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过几十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。

良好的细胞培养微载体具有以下特点：表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高；把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；培养基利用率较高；放大容易；细胞收获过程不复杂；劳动强度小；培养系统占地面积和空间小。

贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有黏附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的黏附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性以及微载体表面理化性质等。

目前市面上常用的微载体有两类，他们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子，一类是以带正电荷的化合物DEAE（二乙氨乙基Diethylaminoethyl）作为配基，用于一般的动物细胞培养，比如GE的Cytodex1，另一类是利用变形的动物明胶-猪胶原蛋白作为配基，通过共价交联在葡聚糖微球表面，为细胞的贴壁生长提供附着，从而增加细胞粘附和增值，该载体更适用于一些不容易贴附的细胞培养。

经过文献检索，Beum Jun Kim等在《Batch, fed-batch, and microcarrier cultures with CHO cell lines in a pressure-cycle driven miniaturized bioreactor. Biotechnol Bioeng.2012 Jan;109(1):137-45》中利用小规模化的生物反应器悬浮培养CHO细胞生产用于商业目的的人源IgG，虽然与传统的滚瓶培养相比能有效的提高靶蛋白产量，但是其仍然使用的是表面包被动物来源蛋白的Cytodex 3，不利于下游纯化。

目前已经有的动物细胞培养用微载体大多数以动物胶原及其衍生物作为包被材料，为克服因应用含有动物来源成分的微载体于动物细胞大规模培养过程中而带来引入病毒的风险以及由此引起的产品申报和监管困难，市场上迫切需要一种不含有动物胶原等动物源材料作为配基的新型细胞培养用微载体，以建立在整个过程中无动物来源成分的细胞培养系统和方案。

发明内容

本发明提供一种无动物来源成分的含有氨基酸或者多肽配基的微载体及其制备方法和其用于动物细胞培养的方法，将该微载体用于动物细胞培养，细胞在微载体表面可以快速附着和扩展，有利于细胞的高密度生长，因为不引入动物源性成分，克服了细胞大规模培养过程中因引入动物来源成分可能带来的产品质量及安全性问题。

本发明的技术方案如下：

一种无动物来源成分的细胞培养用微载体，由配基和三维载体基质通过交联剂交联而成，所述配基为氨基酸聚合物或者人工合成的多肽或者促细胞粘附蛋白，所述配基交联于所述三维载体基质的表面。

优选地，所述三维载体基质的材料选自葡聚糖，壳聚糖，海藻酸钠，聚2-羟乙基甲基丙烯酸中的一种或几种。

一种上述的无动物来源成分的细胞培养用微载体的制备方法，包括以下步骤：

1） 采用表面化学修饰试剂处理三维载体基质，在其表面生成活性基团；

    其中，三维载体基质表面的活性基团优选包括卤代原子、氯甲基、溴甲基、氨基中的一种或几种，优选表面化学修饰试剂选自2-氯丙酰氯、2-溴丙酰溴、2-溴丁酰溴、3-氨甲基硅烷、2-氯丁酰氯中的一种或几种。这些活性基团具有很好的接枝处理性能。表面化学修饰试剂与三维载体基质反应的温度为60-100℃，反应时间为2-5h，采用的溶剂为水或其他自由液，反应物的浓度为1-20 mg/ml，在无氧条件下进行。采用其它修饰试剂时，本领域技术人员可根据一般知识进行反应条件的选取；