[发明专利]一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是细胞工程中真菌原生质体制备与再生技术领域，具体涉及一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法。

背景技术

芦笋(Asparagus officinalis L.)，又名石刁柏，属天门冬科天门冬属宿根性多年生草本植物，是一种具有很高营养价值的保健型蔬菜，在国际上享有“蔬菜之王”的美誉。芦笋茎枯病是由天门冬拟茎点霉(Phmopsis asparagi)引起的世界性重要真菌病害，在美国、欧洲和澳大利亚等地区均有报道。该病主要危害茎杆或嫩笋(stems or spears)，也可侵染枝梗和拟叶，初呈水渍状条斑、后渐变成暗黑色梭条形，病斑中部赤褐色凹陷，大量小黑点状分生孢子器散生其上，最终导致整株枯死并迅速传染至相邻植株。我国作为世界芦笋主产区，茎枯病发生特别严重，近年平均感染率超过50％，常导致成片绝收，已成为制约我国芦笋发展的最主要瓶颈之一，被称作“芦笋癌症”。目前，利用原生质体进行分子转化技术已成为丝状真菌转化、相关分子克隆技术和致病机制研究的重要组成部分，原生质体分子转化技术依赖于制备高效可再生的原生质体，但由于不同种类丝状真菌细胞结构，尤其是细胞壁的结构和组成存在着明显差异，因此制备原生质体的最佳条件和体系也存在着很大差异。国内外尚未见芦笋茎枯病菌的原生质体制备体系相关报道，这不利于对该病原菌进行深入的致病分子机制研究。原生质体的高效再生是后期深入研究其致病分子机制的必需条件，不同的酶解时间及稳渗剂对原生质体再生具有重要影响。为了筛选芦笋茎枯病菌致病力变异菌株，加强对其致病机制的了解，更好地为农业生产上开展抗病分子育种提供基础，需要对其原生质体制备及再生的方法进行研究。

发明内容

针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，使其原生质体的制备数最高达到2.8×10⁷个／mL，再生率最高达到24.0％。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，具体操作步骤如下：

(1)、制备芦笋茎枯病菌分生孢子悬液：

挑取芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi菌丝一环，接种在由50mL燕麦琼脂培养基制成的固体斜面上，在温度25℃、光照12h／d条件下培养10-14d，待出现成熟的芦笋茎枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团块的孢子液，用移液器将该孢子液振荡打碎孢子团块，过滤，取滤液进行倍比稀释，显微镜下计数，得到浓度为1×10⁶个／mL的芦笋茎枯病菌分生孢子悬液；

(2)、制备新鲜菌丝体：

将制备好的分生孢子悬液接种于液体完全培养基中，25℃条件下150r／min摇床培养72h，漏斗过滤，获得新鲜菌丝体；

(3)、酶解菌丝细胞壁：

取1.0g新鲜菌丝体，加入10mL裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶的混合酶液，33℃水浴酶解4.5h，采用1.0mol／L MgSO₄(10m mol／L pH6.98的PBS配制，体积比为MgSO₄：PBS=3：1)做渗透压稳定剂时，原生质体数量达到2.8×10⁷个／mL；

(4)、原生质体分离：

过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度4℃、转速5000r／min、离心分离5min；弃上清液，用1-2mL浓度1.0mol／L的山梨醇溶液洗涤2-3次，收集原生质体重悬于1mL浓度1.0mol／L预冷的山梨醇溶液中保存，得到原生质体悬液；

(5)、原生质体再生：

将原生质体悬液用浓度0.6mol／L的蔗糖溶液稀释100倍，取稀释液0.1mL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板；温度25℃、保持相对湿度60％-75％、光照培养12h／d，培养3-5d直至长出直径约1mm再生菌落；调查再生情况，对形成的菌落记数(A)；以不含稳渗剂的PDA培养基作对照(B)。计算再生率，再生率(％)=(A-B)×100／总原生质体数；

所述的步骤(3)混合酶液由下列重量配比的物质组成：裂解酶15g／L、崩溃酶10g／L、蜗牛酶15g／L、溶剂为1.0mol／L MgSO₄(10m mol／LpH6.98的PBS配制，体积比为MgSO₄：PBS=3：1)，配置好后用直径为0.45μm的超微微孔滤膜过滤除菌；