[发明专利]一种通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵生产纤维素酶的方法，具体的说是一种通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法。

背景技术

纤维素酶（cellulases）是一组可以水解纤维素生成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖酶。纤维素酶是一种复合酶，主要由三种主要成分组成，即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，三种成分协同作用降解纤维素大分子。随着能源需求的不断增加和环境问题的日益严重，纤维素原料作为一种储量丰富、价格低廉的可再生资源，在生物燃料及相关高附加值产品领域的应用已成为一个研发热点。纤维素的酶水解是纤维素生物炼制的主要瓶颈之一，纤维素酶水解目前面临的主要问题是纤维素酶的用量大、成本较高。我国对于纤维素酶有着很高的市场需求，但迄今为止仍未解决规模生产纤维素酶的难题(Y Qu,M Zhu,K Liu,X Bao,J Lin,Studies on cellulosic ethanol production for sustainable supply of liquid fuel in China,Biotechnol.J.,2006,1,1235–1240)。诺维信、杰能科等国外公司产品的垄断造成市场价格居高不下。因此提高纤维素酶的产量，降低纤维素酶的生产成本是纤维素生物炼制生产生物燃料与生物基材料化学品亟待解决的问题。

真菌纤维素酶是诱导酶，诱导物是调控纤维素酶合成的主要因素。许多物质如纤维素、羧甲基纤维素、各种纤维素水解物、乳糖、槐糖等都被认为是生物合成纤维素酶的潜在诱导物，其中槐糖一直以来都被认为是纤维素酶合成最有效的诱导物，在里氏木霉中，其对纤维素酶的诱导效率是纤维二糖的2500倍，是微晶纤维素等其它诱导物的几十到几千倍(M Mandels,FW Parrish,ET Reese,Sophorose as an inducer of cellulase in Trichodermaviride,J.Bacteriol.,1962,83,400–408)。槐糖虽然表现出极强的诱导效果，但由于其天然产量极低，价格极其昂贵（约1200元/mg，Sigma公司产品），难以在实际生产中应用。因此寻找一种制备简单，效果显著的诱导物对纤维素酶的工业化生产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种利用制备简单、效果显著的通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法：以甜叶菊糖苷作为纤维素酶发酵的诱导物，诱导木霉菌产纤维素酶。

进一步的说，在里氏木霉发酵培养基中加入甜菊糖甙（stevioside）或甜菊糖甙类似物诱导里氏木霉发酵生产纤维素酶。

更进一步的说，将木霉菌在土豆培养基（PDA）中培养至培养液中孢子浓度为10⁷-10⁸个/mL；而后将孢子液接种于液体种子培养基中，进行种子培养；再将种子液以1-10%（体积）的接种量接入添加甜叶菊糖苷的发酵产酶培养基中发酵培养，进而产生纤维素酶。种子液以优选的接种量为5%。

再更进一步的说，将木霉菌在土豆培养基（PDA）中以28-32℃培养4-7天，收集孢子，将孢子用无菌水稀释至孢子浓度为10⁷-10⁸个/mL；

将所述孢子液接种于pH值在3.5-5.5的液体种子培养基中，培养18-48小时进行种子培养；优选pH值在4.5；

将上述种子液以1-10%（体积比）的接种量接入pH值在3.5-5.5添加甜叶菊糖苷的发酵产酶培养基进行发酵产酶；其中种子液优选的接种量为5%，优选pH值在4.5；

所述甜叶菊糖苷的添加量为0.4-5g/L。

甜叶菊糖苷是从甜叶菊中提取的一类糖苷，其主要组分甜菊糖甙stevioside分子中含有一个槐糖，其余组分莱鲍迪甙A(Rebaudioside A)、莱鲍迪甙B(Rebaudioside B)、莱鲍迪甙C(Rebaudioside C)、杜克甙A（Dulcoside A）等都含有槐糖的衍生物或结构类似物。目前我国甜叶菊的种植面积非常广阔，产量高，最高亩产可达300公斤，且甜叶菊糖苷的提取工艺已十分成熟，现在我国甜叶菊糖厂有20多家，年生产能力2000吨，甜叶菊糖苷的价格约为150-200元/公斤。