[发明专利]一种从柚类果实中分离纯化柠檬苦素类化合物的方法

说明书

技术领域

本发明属于天然植物中有效成分的提取分离纯化技术领域，具体涉及以柚类果实囊衣为原料，采用大孔树脂、HSCCC（高速逆流色谱）和semi-pre HPLC（半制备型液相色谱）的联用技术同时分离纯化柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸三种柠檬苦素类化合物的方法。 

背景技术

 柠檬苦素类化合物（Limonoid）是三萜类的植物次生代谢产物，主要存在于芸香科和楝科植物中，尤其在柑桔属的种子及果皮中含量丰富。迄今为止，已发现300余种柠檬苦素类似物，其中，在柑橘中含有100多种。柑橘果实中的柠檬苦素类化合物主要包括柠檬苦素类化合物苷元和糖苷。柠檬苦素类化合物苷元主要包括柠檬苦素、诺米林、黄柏酮和异黄柏酮酸等，糖苷一般为D环开环加入一个糖基。柑橘果实中的柠檬苦素类化合物在抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗疟疾、抗炎和昆虫拒食等方面具有重要生物活性。且随着研究的不断深入，相关活性机制也正得到进一步阐明。柠檬苦素类化合物是引起桔汁苦味的主要原因之一。自1989年发现柠檬苦素类化合物具有激活谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性以来，人们对其生物活性进行了大量的研究。近年来研究发现，柠檬苦素类化合物具有抗癌、抗HIV、抗菌和昆虫拒食活性等作用。 

柠檬苦素与诺米林是柑橘中主要的柠檬苦素类化合物。柠檬苦素（limonin）,别名：黄柏内酯、吴茱萸内酯，CAS：1180-71-8，分子式：C₂₆H₃₀O_8,分子量：470.53，化学名称为Limonoate D-ring-lactone； Limonoic acid di-delta-lactone 。存在于柠檬或其他柑橘类水果中一类物质，纯品白色、味苦，结晶状。诺米林（nomilin),CAS ：11630-77-0，分子式：C₂₈H₃₄O₉,分子量：514.57，外观：白色粉末,味道：味苦。异黄柏酮酸，又名异奥巴叩酸，分子式：C₂₆H₃₀O₈，分子量：472.54，该化合物暂无标准品出售。 

随着柠檬苦素类化合物结构的确定以及对其生物活性研究, 柑橘果实柠檬苦素类化合物的开发利用具有广阔的前景。以前人们对柠檬苦素化合物的研究是为了将其从柑橘果实中除去, 以提高柑橘的商品价值。随着对柠檬苦素类化合物生理活性的阐明, 目前人们对柠檬苦素类化合物的需求日益增加。国内外对柠檬苦素类似物的大规模提取分离以及作为功能性食品添加剂的应用研究已经开始, 而且可以预测, 在不远的将来柠檬苦素类似物将被广泛用于功能性食品添加剂、抗癌药物或者杀虫剂中。由于柠檬苦素类化合物结构与极性的相似性，单一的采用一种纯化方式对几种物质的分离纯化变得极为困难。 

发明内容

本发明的目的是提供一种从柚类果实中分离纯化柠檬苦素类化合物的方法，是一种从柚类果实囊衣中分离纯化柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸的方法，该方法可快速有效的从柚囊衣中同时分离纯化柠檬苦素、诺米林和异黄柏酮酸，具体通过以下步骤实现： 

    （1）样品提取与大孔树脂去杂：取一定质量冷冻干燥的柚囊衣粉末用80%丙酮溶液（料液重量比1:20）超声提取三次（40℃），4000 rpm离心20 min，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，溶于体积比为50%乙醇中，约400 mL上HZ-816大孔树脂，树脂的柱床体积（BV）为30 mL,上样流速1 mL/min。上样后的大孔树脂先用4 倍柱床体积（BV）水冲洗以去掉杂质，然后用体积比为75%乙醇400mL洗脱，洗脱流速为0.9 mL/min，收集洗脱液，在旋转蒸发仪上50℃蒸干得大孔树脂除杂后的粗提物粉末。

（2）高速逆流色谱（HSCCC）分离纯化：配制正己烷-正丁醇-甲醇-水（体积比2:1.3:1:3）溶剂体系，充分摇匀过夜后，上相为固定相，下相为流动相，固定相首先以20 mL/min流速泵入HSCCC，稳定后，开启逆流色谱仪将转速调至1000 rpm，同时流动相以2 mL/min的速度通过HSCCC，待流出液分层后将大孔树脂粗提物粉末20mg溶于1mL上相与4mL下相的混合液中进样，根据色谱仪检测器采集的图谱将不同的峰开始与结束之间的流出液分别收集，分为组份Ⅰ（进样后约60min-80min）,Ⅱ（进样后约125min-145min）,Ⅲ（进样后约150min-175min）。