[发明专利]用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及用于检测慢性乙型肝炎耐药性的多重连接探针实时荧光PCR技术。 

背景技术

慢性乙型肝炎仍然是全世界的重大公共卫生问题。在中国，拉米夫定和阿德福韦这两种药物现已成为治疗慢性乙肝的一线药物。但是HBV耐药的产生成为长期治疗慢性乙肝成功与否的主要障碍。因此检测患者感染的HBV是否对拉米夫定和阿德福韦耐药，对临床抗HBV药物的选择非常重要。目前多种多样的用于乙肝耐药检测的方法被报道，包括PCR产物直接测序法、反向线性杂交法(INNO LIPA)、基因芯片和实时PCR等技术。PCR产物直接测序法和反向线性杂交法(INNO LIPA)是目前公认的可用于临床检测的方法。基因测序技术虽然是金标准，但是灵敏度较低,不能检测20%以下的突变株。INNO LIPA方法灵敏度高，但使用INNO LiPA法的试剂和配套仪器成本较高。基因芯片技术通量高，但检测费用贵，不利于临床推广。随着分子诊断技术的发展，方便快捷的实时荧光定量PCR方法被应用于HBV耐药的检测，其原理主要是依靠荧光探针Tm值的差异来区分点突变。但是这种方法对Tm值接近的突变位点、邻近的突变位点或“沉默”突变分辨力较差，而且需要将突变位点设置在探针的中间部位（例如MGB探针和锁核酸探针），探针设计常受到限制，影响了其检测通量，目前大多数只能检测单个位点。这里我们介绍一种新的检测方法，叫做MLP-rtPCR。该方法结合了MLPA技术通量高和实时PCR方法灵敏、快速和经济的特点，可以在同一反应管中同时快速检测与HBV拉米夫定和阿德福韦耐 药相关的5种突变，提高了其检测通量，包括HBV P基因逆转录区rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T的点突变。MLPA技术首先由Schouten于2002年建立。MLPA多达40对的探针，主要用于检测基因拷贝数的变化。同时，也可检测单核苷酸多态性或者单个碱基突变。目前有利用该技术对结核分枝杆菌进行基因分型及耐药检测。但是利用的是传统的MLPA技术，即利用毛细管电泳来定量分析待检DNA靶序列或利用芯片杂交技术来对病原体核酸进行定量和分型，这需要合成大量不同长度的探针，或者需要探针固定、杂交和洗脱等复杂的操作步骤。然而，以TaqMan探针作为标签的多重实时荧光定量PCR可省去毛细管电泳或者芯片杂交检测步骤，直接实时扩增连接后的MLPA探针，判定结果直观，方便快捷。因此，这是我们首次将MLPA技术和荧光定量PCR技术相结合来建立一种检测单碱基突变的方法。并将其用于乙肝耐药的检测。 

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，其能检测拉米夫定和/或阿德福韦耐药性，具有较高的特异性和敏感性。 

本发明介绍一种新的检测方法，叫做MLP-rtPCR。可以在同一反应管中同时快速检测与HBV对拉米夫定和阿德福韦耐药相关的5种突变，包括HBV P基因逆转录区rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T的点突变。 

用于检测HBV拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光PCR试剂盒，所述多重连接探针实时荧光PCR试剂盒包括MLPA探针组、填充序列和通用引物组成，所述MLPA探针组分别是针对HBV的P基因逆转录区的rtM204V和/或rtM204I和/或rtA181T和/或rtA181V和/或rtN236T位点而设计的特异性序列。