[发明专利]口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光RT-PCR检测方法的建立及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，尤其是用于口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的同时检测与鉴定。 

背景技术

在过去的10多年里，在政府推动、加工和消费需求拉动下，中国奶牛业取得长足的发展，由一个贫奶国家逐步发展成一个奶业大国。首先进境奶牛数量逐年增多。自1997年至2007年中国奶牛存栏量增长了4.84倍；2009年全年进口奶牛4.5万头，2010年进口奶牛8万头，2011年进口奶牛10万头。其次国内奶牛规模化养殖程度大幅提高。2010年全国百头以上奶牛养殖存栏量占全国的28.48％，比2008年提高8.7个百分点，越来越多的以现代牧场为代表的万头以上的超大规模牧场也相继建成并投入使用。随着奶牛的大量进口、国内流通及奶牛饲养规模的不断扩大，给动物疫病防治带来前所未有的压力。 

口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病都是猪的重要病毒性传染病，以口和蹄部产生水疱性损伤为特征，其临床症状极为相似，引起严重的公共卫生问题，均被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。3种水疱性疾病在临床症状上无法区别，必须通过实验室检测进行鉴别诊断。目前，对3种疫病的诊断多采用病原分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长，也可使用PCR技术进行检测，但尚无稳定的操作性强的能同时鉴别3种病毒的方法。为此，有必要建立能同时进行3种疫病快速检测方法，以便动物疫情爆发时尽快采取有效的针对性防控措施。本研究针对口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒分别设计多对特异性引物及探针，经过前期试验筛选后选取灵敏度和特异性良好的引物及探针组合，优化反应条件和引物探针应用浓度，最终实现经过一次多重荧光RT-PCR试验同时鉴别检测三种动物疫病的目的。 

发明内容

我们成功设计和合成了针对口蹄疫病毒3D蛋白、水泡性口炎病毒N蛋白、猪水疱病病毒VP1蛋白的相应基因的特异性引物和探针。基于此引物和探针，我们建立了多重荧光RT-PCR检测方法。该方法通过对多种相关病毒的检测、标准曲线的构建、特异性实验与灵敏度试验等，说明该方法具有较高的特异性、灵敏度、稳定性和高效性。 

在本发明的第一方面，提供了一种针对口蹄疫病毒3D蛋白、水泡性口炎病毒N蛋白、 猪水疱病病毒VP1蛋白相应基因的的特异性引物和探针序列，如SEQ NO：1至9所示。 

在本发明的第二方面，提供一种同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面所述引物和探针。 

在一个实施方案中，所述试剂盒包括以下成份： 

1)SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8所示的引物； 

2)SEQ ID NO：3、6、9所示的探针； 

以及多重荧光PCR缓冲液、氯化镁、dNTP、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶和水。所述引物和所述探针在所述扩增检测中的终浓度均具体为0.2uM-0.4uM。 

其特征在于如SEQ NO：3所示的口蹄疫病毒3D蛋白的基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：6所示的水泡性口炎病毒N蛋白的基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：9所示的猪水疱病病毒VP1蛋白的基因探针5’端由HEX标记，3’端由BHQ2标记。 

所述试剂盒在检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病中的应用，其特征在于可以检测到10²个拷贝的病毒。 

在本发明的第三方面，提供一种同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的PCR扩增方法，该方法使用第二方面所述的试剂盒。 

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤： 

1)提取病毒RNA； 

2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的PCR反应预混液，混匀后短暂离心分装到PCR管中； 

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增； 

4)收集荧光信号，检测Ct值。 

所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：