[发明专利]一种杀虫防病促生长的工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种杀虫防病促生长的工程菌株TLB15，其特征在于由能够防治蔬菜多种病害且对蔬菜具有促生长作用的枯草芽孢杆菌TL2和具有杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌B7216构建的新菌株。

2.如权利要求1所述杀虫防病促生长的工程菌株TLB15的构建方法，其特征在于应用热-紫外灭活两亲本，通过损伤互补原理将两个菌株的基因和优势构建在一个新的菌株细胞内 ， 获得新的具有杀虫防病促生长的多重功能的工程菌株TLB15。

3.如权利要求2所述杀虫防病促生长的工程菌株TLB15的构建方法，其特征在于方法，包括下列操作步骤：

（1）两亲本菌体的制备

将枯草芽孢杆菌TL2和苏云金芽孢杆菌B7216接种到斜面完全培养基，活化后立即取菌一环转接至30mL液体完全培养基，于30℃恒温摇床中培养24h，制得两亲本菌体；

（2）两亲本原生质体的制备

取步骤（1）培养的两亲株24h培养液将其培养至两亲本的对数生长期，镜检后将两亲本用SMM高渗缓冲液制成10³个/ml细菌的菌悬液，B7216菌悬液加入1.0mg/ mL的溶菌酶后酶解70min制得B7216原生质体，TL2菌悬液加入1.25mg/ mL的溶菌酶后酶解50min制得TL2原生质体；

（3）两亲本原生质体的融合

    取步骤（2）中制备的TL2原生质体悬浮液5ml置于小试管，在60℃水浴条件下水浴35min，使TL2原生质体的完全被灭活，取步骤（2）中制备的B7216原生质体悬浮液5ml置于小试管，在15W紫外灯下照射25min，垂直照射距离为30cm，使B7216原生质体的完全被灭活；

取灭活的两亲株原生质体各2ml混合,4000rpm离心15min，弃上清液，再向沉淀液中加入40%（w/v）PEG6000(在SMMD高渗液中加入40%的PEG6000，pH=7.0，用于原生质体的融合，)的SMMD溶液(SMM缓冲液中加DNA酶5ug/mL，临时配制备用，在原生质体的融合过程中排除亲本的转化，)4ml与0.4ml的新生磷酸钙溶液混合均匀，37℃水浴保温10min得到融合的原生质体，

（4）融合子的再生与传代培养

取步骤（3）中融合后的原生质体用SMM高渗缓冲液将融合液稀释10倍，取0.1ml涂布于高渗基本再生培养基上，置于30℃恒温箱中培养3天，得到了17个融合子，将获得的17个融合子（简称为TLB1，TLB2，TLB3…………TLB17，）用牙签点接于完全培养基平板上，放于30℃恒温箱中培养24h后再影印到再生培养基平板上，传代10次，镜检后用试管斜面保存；

（5）融合子的初筛

初筛采用平板拮抗试验测定17个融合子对辣椒疫霉病和黄瓜枯萎病的抑菌作用，平板拮抗采用菌块对峙培养法对已纯化的17株内生细菌融合子进行筛选，初步选出TLB1，TLB2和TLB15三个菌株与亲本的防病效果相当；

（6）融合子的复筛

复筛采用镜检晶体（因为晶体关系到融合菌株是否具有杀虫作用）及对小菜蛾的杀虫试验，显微镜下观察到只有TLB15产生晶体，且晶体量变少，不及亲本B7216的晶体量，采用浸叶法测定生防菌株对小菜蛾的室内毒力测定，根据杀虫试验，复筛最后选出TLB15为稳定融合子。

4.如权利要求3所述的杀虫防病促生长的工程菌株TLB15的构建方法,其特征在于所述步骤(2）中，B7216最合适的酶解浓度为1.0mg/ml，酶解时间为50min;TL2最合适的酶解浓度为1.25mg/ml, 酶解时间为50min。

5.如权利要求3所述的杀虫防病促生长的工程菌株TLB15及其构建方法,其特征在于所述步骤(3）中，TL2原生质体热灭活的时间为35min，B7216原生质体热灭活时间的25min。

6.如权利要求1所述杀虫防病促生长的TLB15的应用，其特征在于工程菌株TLB15经固态发酵后，经加工制得用于农业病、虫害生物防治的可湿性粉剂。

7.如权利要求1所述杀虫防病促生长的工程菌株TLB15的应用，其特征在于用于防治小菜蛾、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病及促进辣椒和黄瓜的生长。