[发明专利]重组载体及应用该重组载体的转基因鱼卵和生物材料

说明书

技术领域

本发明为一种生物医学材料的制备技术，特别是一种重组载体及应用该重组载体而产生的转基因鱼卵与生物材料。 

先前技术 

由于胶原蛋白是生物医学材料的重要组成材料，主要包括使组织生长、整型、烧烫伤敷料、伤口愈合等功能，并且市场规模不断地扩大，因此，开发更具医疗价值及更多样性的胶原蛋白及其衍生物，以应用于各种用途，是现今研发者所希望解决的课题。 

目前生产重组胶原蛋白的表达系统包括大肠杆菌（Escherichia coli；E.coli）、酵母菌、哺乳动物细胞株、昆虫细胞株、转基因动物以及转基因植物。然而，大肠杆菌表达系统没有翻译后修饰。酵母菌表达系统缺乏脯氨酸4-羟化酶活性，但甲醇酵母中的胶原蛋白产量却又是这些表达系统中最高的。哺乳动物细胞株的表达系统产量低且受限于特定细胞类型。昆虫细胞的表达系统中脯氨酸4-羟化酶活性又低。而转基因动物（如，蚕或小鼠）以及转基因植物（如，烟草），其胶原蛋白产物会过度交联。 

目前已建立有含有编码人类脯氨酸4-羟化酶以及胶原蛋白的基因的杆状病毒表达系统（参照美国专利第5,077,214号以及第5,593,859号）。然而，经转染的昆虫细胞在72小时内死亡，造成仅有暂时性的重组胶原蛋白生产。此外，由于胞溶作用，因此将很难回收或纯化重组胶原蛋白。而且，杆状病毒对于内质网或高尔基氏体的破坏更限制了胶原蛋白的生产。 

发明内容

在一实施例中，一种生物材料包括：由鱼体生产并获得的重组人类前 胶原蛋白或胶原蛋白。 

在一些实施例中，此生物材料更包括鱼体的至少鱼鳞，并且各鱼鳞具有表达的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。 

在一些实施例中，重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白是由转移到鱼体中的人类胶原蛋白基因表达的。 

在另一实施例中，一种转基因鱼卵包括鱼类染色体以及重组载体。重组载体整合到鱼类染色体中，并且此重组载体包括人类胶原蛋白基因。 

在又一实施例中，一种重组载体包括上游基因以及人类胶原蛋白基因。上游基因是由鱼体获得，而人类胶原蛋白基因是连接在上游基因的下游。其中，上游基因可为在鱼体中存在的启动子、增强子或其组合。 

在一些实施例中，重组载体更包括报道基因，并且此报道基因是连接在人类胶原蛋白基因的下游。 

综上，根据本发明的重组载体及应用其产生的转基因鱼卵和生物材料可提供能于特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的转基因鱼，以利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体的特定部位作为生物材料或纯化出其中的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。所述生物材料已在位于德国D-38124布伦瑞克茵荷芬斯特街7B号的德国微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏日期为2013年8月20日，保藏编号为DSM27616，分类命名为：斑马鱼角蛋白4启动子在tol2载体连接第1型α1人类胶原蛋白基因（zebrafish Keratin4promoter link human Collagen1A1gene in tol2vector，pT2-zK4hC1A1）。 

附图简要说明 

图1为根据本发明一实施例的转基因鱼卵的转化方法的流程图。 

图2为根据本发明一实施例的重组载体的示意图。 

图3为图1步骤S10的一实施例的详细流程图。 

图4为图3步骤S110的一实施例的详细流程图。 

图5为图3步骤S120的一实施例的详细流程图。 

图6为图3步骤S130的一实施例的详细流程图。 

图7为图3步骤S140的一实施例的详细流程图。 

图8为具有第1型人类胶原蛋白基因的重组质粒的一实施例的示意图。 

实施方式 

以下所述的「第一」至「第二十三」等序号用语是用于区别所指的组件，而非用于排序或限定所指组件的差异性，且也非用于限制本发明的范围。 

参照图1，一种转基因鱼卵的转化方法包括构建具有人类胶原蛋白基因的重组载体（步骤S10）、利用适当的限制性酶（Restriction Enzyme）将构建好的重组载体（Recombinant Vector）变成线性（步骤S20）、以及将线性的重组载体引入鱼类的胚胎中以整合到胚胎中的鱼类染色体中（步骤S30）。