[发明专利]用于检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的引物对、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体涉及用于检测二斑叶螨的阿维菌素抗药性的引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术

二斑叶螨Tetranychus urticae属于蜘蛛纲蜱螨亚纲真螨目叶螨科，俗称红蜘蛛，是世界性的重要农业害螨，为害寄主繁多，包括果树、蔬菜和棉花、小麦等重要农作物。叶螨以成螨和幼若螨聚集在植物叶片的背面进行刺吸为害，造成叶片上出现失绿斑点，严重时造成叶片干枯脱落，极大地影响作物的产量和品质。

由于叶螨体型微小、发生世代多、繁殖速度快、发育历期短的特点，该螨极易产生抗药性。阿维菌素作为抗生素类杀虫杀螨剂，通过刺激虫体产生γ-氨基丁酸，阻断运动神经信息的传递，使害虫在几个小时内迅速麻痹、拒食、缓动或不动，因此，该药剂一度成为防治二斑叶螨的首选药剂。但是，实验表明阿维菌素继代选育二班叶螨20代，二斑叶螨会对阿维菌素产生较高抗性。而我国各地区的用药情况存在较大差异，导致二斑叶螨对阿维菌素的抗性也不同，为了更好地指导农民合理用药，就需要明确二斑叶螨对阿维菌素的抗药性。然而，传统的叶螨抗药性监测采用玻片浸渍法，试虫微小操作不易，且需要测试虫量很大（至少700头），至少24小时后才能观察测试结果，通过与相对敏感品系的对比，才可知其对药剂的抗药性水平，因此耗费时间很长。

谷氨酸是脊椎动物和无脊椎动物神经系统内重要的神经递质，谷氨酸与突触后受体结合后，开启氯离子通道，称为谷氨酸门控的氯离子通道（Glutamate-gated chloride channel,GluCl）。以往研究已经表明，谷氨酸门控氯离子通道是阿维菌素类杀虫剂的作用靶标之一，GluCl的第二跨膜区下游出现点突变（9299S）导致果蝇对伊维菌素产生了10倍抗药性（Kane et al.,2000），线虫上也发现了该基因不同位点的点突变（Njue et al.,2004）。Kwon et al.(2010,Insect Molecular Biology,19(4):583-591)报道二斑叶螨抗性种群中GluCl的点突变（G323D）导致其对阿维菌素产生抗药性的分子机制。

在此基础上，本发明针对该点突变，设计二斑叶螨抗性和敏感种群中包含该点突变位点的特异性片段，采用特异性等位基因PCR扩增技术（PCR amplification of specific alleles，PASA，也称allele-specific PCR，AS-PCR）分别从抗性和敏感种群中扩增出特异性条带，根据条带的有无直接判别二斑叶螨个体（种群）对阿维菌素是否产生了抗药性。该方法简便、快速，可实现二斑叶螨种群对阿维菌素抗药性的高通量检测。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测二斑叶螨个体（种群）对阿维菌素是否产生了抗药性的引物对。

本发明的再一目的是提供用于检测二斑叶螨个体（种群）对阿维菌素是否产生了抗药性的试剂盒。

本发明的再一目的是提供检测二斑叶螨个体（种群）对阿维菌素是否产生了抗药性的方法。

本发明提供了用于检测二斑叶螨对阿维菌素是否产生了抗药性的引物对，其包括：

（1）抗性和敏感种群的检测用上游引物分别为：RF：5’-AAGCTGTTGACATTTGGACGA-3’和SF：5’-AAGCTGTTGACATTTGGACGG-3’；

（2）以及与上述上游引物配对使用的共用下游引物，优选地，PCR扩增时和公用的下游引物（3'405F）分别配对进行扩增。RF和3'405F（TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA）组成抗性引物对，SF和3'405F（TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA）组成敏感引物对。

根据本发明还提供了用于检测二斑叶螨对阿维菌素是否产生了抗药性的试剂盒，所述试剂盒包括：

（1）抗性和敏感种群的检测用上游引物分别为：RF：5’-AAGCTGTTGACATTTGGACGA-3’和SF：5’-AAGCTGTTGACATTTGGACGG-3’；

（2）以及与上述上游引物配对使用的共用下游引物，优选地，PCR扩增时和公用的下游引物（3'405F）分别配对进行扩增。RF和3'405F（TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA）组成抗性引物对，SF和3'405F（TGA ATC CTT GGC GGT GTC AAA）组成敏感引物对。