[发明专利]脂肪干细胞及其干细胞分泌物的培养与量产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种干细胞及其干细胞分泌物的培养与量产方法，特别是涉及一种脂肪干细胞的培养及量产其干细胞分泌物的方法。

背景技术

基于近年来生物科技与医疗技术的蓬勃发展，干细胞因其特有的分化、增生及组织修复潜能，使其在生物医药产业日趋重要。无论是从全球干细胞相关公司数量、市值的大幅成长，或是美国食品药物管理局(FDA)接受以干细胞申请的临床案件的逐年上升等情况来看，均显示出干细胞治疗已成为国际生物科技产业重点发展项目。

然而，干细胞的快速分化能力常使其在第3至4次继代后，逐渐失去其干细胞特性，以致后续实验往往无法符合临床预期。即使是初代培养的干细胞，以传统培养法的干细胞其特性也与临床表现不同。此外，不同于骨髓干细胞、脐带血干细胞及胚胎干细胞等检测体来源取得较不容易，脂肪为相对容易的检测体取得来源，且检测体取得过程对捐赠者产生的不适感较其他来源轻缓。

此外，除了干细胞本身的医疗应用以外，越来越多针对干细胞分泌物的研究显示，干细胞分泌物的复合组成因子对于再生医学也有良好表现。欧美均有研究报导，以干细胞分泌物培养受损的肝脏细胞或其他哺乳类动物组织，均有细胞增生与组织修复的成果。

因此，现阶段研究的首要目的即在于延缓干细胞分化、维持其干细胞特性并同时大量培养干细胞及其干细胞分泌物，以利后续研究。如何通过改良传统干细胞培养方法，进而制造生产大量干细胞与其干细胞分泌物以符合当下细胞生物学界的需求，已成了亟待解决的一个课题。

发明内容

基于上述公知的问题及需求，本发明主要以不同于传统细胞培养方式的创新3D培养法延缓细胞分化并维持干细胞特性，同时搭配定时灌流系统以刺激干细胞分泌物产生。由于3D立体环境培养法对干细胞特性的维持与其分泌物的组成分的影响，皆可应用于再生医学且作为其他医疗领域的发展潜能。因此本发明以立体培养法制造生产大量干细胞与其干细胞分泌物符合当下细胞生物学界的需求。

本发明的一个目的为提供一种脂肪干细胞培养及量产其干细胞分泌物的方法，利用创新研发的3D培养技术大量培育脂肪干细胞且量产并收集其干细胞分泌物以利后期研究发展出个人化干细胞产品。

上述脂肪干细胞的培养方法的步骤包括：(A)收集脂肪细胞样本；(B)分离该脂肪细胞样本中的脂肪干细胞；(C)将该脂肪干细胞以干式细胞种植法分布于三维载体上，并置于一生物反应器中，以定时定量培养液灌流与细胞定时断食法进行培养；(E)收集由该脂肪干细胞分泌的干细胞分泌物；其中该干细胞分泌物至少包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、介白素-6(Interleukin-6,IL-6)、1型胶原蛋白(collagen type I)其中之一或其组合。

在上述方法中，较佳地，步骤(C)进一步包括以定时定量培养液灌流与细胞定时断食法进行培养；每个生物反应器装载的三维载体的数目介于100～1500；培养获取的脂肪干细胞总数量为1×10⁸～1×10⁹个/培养瓶。干细胞分泌物的血管内皮生长因子的浓度可介于0～2090pg/ml、肝细胞生长因子的浓度可介于0～1780pg/ml、介白素-6的浓度可介于0～523pg/ml、1型胶原蛋白的浓度可介于0～42ng/ml，，且脂肪干细胞在三维载体上的贴覆率较佳地可达到90%。

本发明相对于传统细胞培养法有下列优势：

通过三维培养脂肪干细胞的方法，可省去繁复操作步骤与人力、减少设备空间、量产干细胞分泌物以及节省细胞培养液的经济成本。此外，干式细胞植入技术可改善以往3D培养法细胞贴覆率较差的瓶颈、并以定时定量培养液灌流与细胞定时断食法，改变干细胞分泌物的组成及生产量，且在经济效益方面可节约8至10倍的培养耗材用量与支出。通过本发明揭露内容，可快速大量培养脂肪干细胞及大量生产其干细胞分泌物，以提供疾病治疗、细胞修复及再生医学等领域的研究应用。独创的细胞培养系统也可做为其他种类细胞培养的研究开发应用。

附图说明

图1为显示本发明脂肪干细胞的培养方法的步骤流程图；

图2为脂肪干细胞的纯化步骤流程图；

图3为脂肪干细胞的培养以及干细胞分泌物的生产步骤流程图；

图4显示经纯化培养后的脂肪干细胞存活率；

图5显示以干式细胞种植法将细胞液均匀分布于培养瓶中的三维载体后的细胞贴覆率；