[发明专利]Cry1Ab/Cry1Ac抗虫基因RPA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及的是用于重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Ploymerase Amplification, RPA）技术快速鉴定抗虫转Bt基因植物中Cry1Ab/Cry1Ac基因（Cry1Ab基因，Cry1Ac基因或Cry1Ab/c融合基因）成分。

背景技术

目前DNA扩增是核酸检测的主要方法，常用的PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。近年来，核酸恒温扩增技术得到了长足的发展，与传统PCR相比核酸恒温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。RPA技术是模拟生物体内DNA复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来，利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时, 在单链DNA结合蛋白的帮助下, 使模板DNA解链, 引物与模板DNA开始配对形成复制所需自由的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸, 形成新的DNA互补链反应产物也是以指数级增长。与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物长度通常为30-35nt。引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度增加，引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在RPA扩增体系中加入一个荧光标记的探针便可实现模板扩增的实时监测，该探针中部两个T碱基上各标记一个荧光集团（FAM和BHQ1），在两个集团之间有一个脱碱基位点（dSpacer），该位点可被一种来自大肠杆菌的核酸外切酶识别，该酶具有3’-5’外切酶活性，可以使两个荧光集团分离，从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步。结合一个便携式的荧光扩增检测仪便可在10-20分钟内检测到荧光曲线。RPA技术极大地缩短了检测时间，简化了反应程序，与DNA快速提取技术相结合使野外检测成为可能，具有广泛的应用前景。

PCR技术对转基因产品检测的方法有筛选检测，基因特异性检测，构建特异性检测和转化体特异性检测。其中基因特异性检测是指对转化的外源目的基因进行检测。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种寄生在昆虫体内的细菌，它可以产生由Bt基因编码的杀虫晶体蛋白使一些宿主害虫致病。通过生物技术手段将Bt杀虫基因整合到农作物基因组中，使一些作物具有抗虫特性。

目前转Bt基因植物及其产品种类繁多，引起了公众的广泛关注，建立一种快速简便的室外检测方法具有重要意义，可用于市场监管和例行监测，为转基因生物安全管理提供技术支撑。在已报道的转基因植物检测方法中，主要是利用PCR仪在实验室中进行常规的检测，该方法还不能进一步满足转基因产品的快速检测。国内外目前还没有利用RPA技术对转Cry1Ab/Cry1Ac基因植物做基因特异性鉴定。

发明内容

针对上述领域的空白，本发明提供了准确、快速、简便检测转Cry1Ab和/或Cry1Ac基因（Cry1Ab基因，Cry1Ac基因或Cry1Ab/c融合基因）的水稻、玉米及棉花等基因特异性的RPA检测方法。

本发明提供的技术方案是：一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转Cry1Ab和/或Cry1Ac基因抗虫植物的引物，其正向引物序列如SEQ ID No.1所述，反向引物序列如SEQ ID No.2所述，探针如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转Cry1Ab/Cry1Ac基因植物的方法：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行荧光快速检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品为转Cry1Ab/Cry1Ac基因产品。实施步骤为：向RPA扩增试剂盒推荐反应的50μL扩增体系中加入引物各2μL（10μmol/L），探针0.5μL（10μ mol/L），模板DNA 50ng。RPA扩增检测仪（或荧光定量PCR仪）39摄氏度反应15分钟，或者当待测样品的 DNA为粗提取DNA为模板时，反应30分钟。