[发明专利]检测哺乳动物基因组三核苷酸重复序列的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及核苷酸检测领域，具体涉及检测哺乳动物基因组三核苷酸重复序列的方法及其应用。

背景技术

三核苷酸重复（trinucleotide repeat，TNR），一种在哺乳动物中普遍存在的三核苷酸序列的扩增，其在蛋白或RNA水平上通过获得或失去性突变而影响到正常基因功能，引发与神经-肌肉系统相关的退行性疾病。三核苷酸重复的这种不稳定性在组织及其传代过程中显现出动态的变化，并且较长的重复序列与较短的相比，更有可能发生重复数增加的突变。同时由于重复序列的长度与疾病的严重性及病人发病的年龄相关，因此大部分三核苷酸重复引起的疾病都呈现出遗传早现的特征。随着发育、表观、增殖甚至环境等因素的变化，三核苷酸重复的不稳定性在个体、组织以及个体不同的年龄阶段之间都表现出复杂的样式。

在人类基因中，三核苷酸重复的扩增引发了一系列的常染色体显性或隐性的疾病紊乱，比如多聚谷氨酰胺疾病（亨廷顿舞蹈症，各种类型的脊髓小脑性共济失调，脊髓延髓肌肉萎缩症等），Friedreich共济失调，脆性X综合症，营养不良性肌强直等。现在有三十种左右的已知疾病与三核苷酸重复相关，其中多聚谷氨酰胺疾病（亨廷顿舞蹈症，各种类型的脊髓小脑性共济失调，脊髓延髓肌肉萎缩症等）与CAG重复相关；Friedreich共济失调与GAA重复相关；脆性X综合症与CGG重复相关；营养不良性肌强直与CTG重复相关；等等。其中，各个疾病的确切发生发展都依赖于对应重复序列在基因中的定位，还有对应致病基因的时空表达方式及其功能。每个重复序列扩增引发相关的疾病都显现出确切的重复片段阈值，也就是当重复片段数目超过该确切的阈值时，可能会在蛋白或RNA水平上发生积累改变，从而引发基因功能的致病改变。

因此，三核苷酸具体重复数目对于相应基因受累疾病的预测、及发病病程、病因等均存在重要的提示作用，检测三核苷酸重复数目对于研究发病机制尤为必要。现在主要的方法通过设计引物覆盖已知具体基因序列，再进行PCR反应扩增出对应基因的重复片段，通过测序手段进行确认。然而对于多基因突变相关的神经系统疾病，包括前面提及的单基因突变疾病，其中三核苷酸重复在多基因水平上所扮演的角色进行研究，则需要对研究手段需要更多的考虑。目前的研究手段中，即使全基因关联研究（GWAS）对于这类多基因相关的疾病中的各个基因，尤其是三核苷酸重复所在基因所起的作用也无法进行具体分析，因此有必要开发出全基因组角度的对三核苷酸重复序列进行系统研究的方法。

在人类基因组中，锌指蛋白是最为常见的DNA结合基序，占到2-3%的百分比（“Initial sequencing and analysis of the human genome”，International Human Genome Sequencing Consortium,Nature2001,409,860–921）。锌指蛋白涉及到一系列的生物功能，包括发育、分化、抑制肿瘤等等（S.Iuchi和N.Kuldell，Zinc Finger Proteins:From atomic contact to cellular function,Landes Biosciences,Georgetown,TX,2004）。锌指蛋白结构域由二十至三十个氨基酸残基组成，它们形成由锌离子与指环结构上的Cys和His残基结合形成稳定的二级结构。根据与锌离子配位的氨基酸种类和数目，可以将锌指蛋白分成多个种类。其中，经典的C₂H₂锌指蛋白最为常见，在锌离子协助下折叠形成ββα二级结构，而α螺旋上的-1,3和6位氨基酸残基参与锌指蛋白特异地结合靶点DNA序列。并且锌指蛋白大部分由多个C₂H₂锌指蛋白通过串联连接的方式构成。由于C₂H₂类锌指结构域的独立结构及其特异分子识别特性，被逐渐尝试用来设计新锌指蛋白，使其具有新DNA结合能力，通过与不同作用结构域的融合，可能用于各种生物医学应用中。

本发明利用C₂H₂锌指蛋白的可组装及改造后特异识别DNA的特征，对三核苷酸重复序列进行特异性结合，利用生物化学的方法，将三核苷酸重复序列体外富集出，经过高通量测序手段和后续生物信息学分析，从全基因组角度将三核苷酸重复所在的基因位点找出，以寻找未知的参与疾病发生的关键基因，以解决现在仍无法全面了解的症结所在。

发明内容