[发明专利]Survivin启动子调控CD基因的重组腺病毒载体构建及其应用有效

专利信息
申请号: 201310391654.7 申请日: 2013-09-02
公开(公告)号: CN103484462A 公开(公告)日: 2014-01-01
发明(设计)人: 邵红伟;黄树林;沈晗;吴凤麟;张文峰;李家明 申请(专利权)人: 广东药学院
主分类号: C12N15/113 分类号: C12N15/113;C12N15/55;C12N15/861;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
代理公司: 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 代理人: 陈卫
地址: 510006 广东*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: survivin 启动子 调控 cd 基因 重组 病毒 载体 构建 及其 应用
【说明书】:

技术领域

    发明涉及一种重组腺病毒,更具体地,涉及一种存活素(survivin)启动子靶向性调控自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)的重组腺病毒载体构建,以及该重组腺病毒在抗肿瘤治疗药物中的应用。

背景技术

    癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病之一,也是当今科学研究面临的重大难题之一。传统的治疗方法难以根除肿瘤且伴随着严重的副作用。随着生命科学的不断发展,基因治疗有望成为取代传统肿瘤治疗的的一个新手段。而基因治疗能否成功应用于临床实践的关键问题是治疗的靶向性,良好的靶向性才能保证治疗的安全性和有效性。

作为凋亡抑制蛋白家族的新成员,Survivin基因是在1997年由Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1) cDNA在人类基因组文库的杂交筛选中首次分离出的。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis, IAP)家族的成员,正常情况下它仅表达于人类的胚胎组织,在除甲状腺、胸腺及生殖腺以外的分化成熟的成人组织中几乎无表达,另外,它过表达于绝大多数常见的恶性肿瘤组织如肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、何杰金氏病、黑色素瘤等,而在这些癌组织中相对应的正常组织并不表达Survivin,具有高度的肿瘤组织特异性。因此,利用survivin的这一特性进行肿瘤靶向性的治疗具有重要的研究价值。

5氟尿嘧啶(5-FU)是临床应用较为广泛的抗肿瘤化疗药物,其在体内的代谢产物5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸(FdUMP)能够抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的活性,导致 dTTP 池的耗尽,而最终抑制 DNA 的合成,达到杀死肿瘤细胞的目的。5-FU可由5氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基转化而来,而这一过程可由某些微生物的胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)进行催化。CD由于能将原本无毒的前体药物5-FC转化成具有细胞毒性的化疗药物5-FU,因此又被称为前药基因或者自杀基因,基于这一原理,当前发展了一种CD/5-FC自杀基因系统用于抗肿瘤治疗的研究。

CD/5-FC系统相较于另一种自杀基因系统——单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)/更昔洛韦(ganciclovir, GCV),有更强的旁观者效应,这是由于5-FU不需要细胞间隙连接通讯来杀伤未转化的临近肿瘤细胞,而细胞间隙连接通讯在肿瘤细胞中往往是下调或者缺失的。另外,免疫因素也参与了CD/5-FC系统杀伤肿瘤的作用:一方面经CD/5-FC途径作用后,部分死亡的肿瘤细胞能够刺激机体产生急性炎症反应,导致各种免疫效应因子在肿瘤局部积聚,从而有助于免疫细胞的浸润;另一方面随着部分肿瘤细胞的死亡,增加了肿瘤抗原的免疫原性,有助于免疫系统对肿瘤的识别和杀伤。

但是在缺乏表达特异性的情况下,CD/5-FC不仅能够杀伤肿瘤细胞,也会作用于正常细胞,对正常组织造成严重损伤,因此难以在肿瘤患者身上取得理想疗效。为了使治疗基因CD能够选择性地表达于肿瘤细胞中,从而提高肿瘤治疗靶向性,保护正常组织,应用肿瘤组织特异性的启动子来介导治疗基因的表达是实现这一目的的有效手段。

发明内容

本发明的目的之一为提供一种启动子,来调控基因CD能特异性的选择肿瘤细胞,提高肿瘤治疗的靶向性。

    根据以上发明目的,首先提供一种Survivin启动子,所述的启动子的核苷酸序列如SEQ NO:1 所示。

    根据需求再提供一种胞嘧啶脱氨酶基因,所述的胞嘧啶脱氨酶基因受上述的Survivin启动子调控。

    更进一步的提供一种重组腺病毒,其特征在于,所述的腺病毒包含了根据上述的胞嘧啶脱氨酶基因。

    更具体地,提供一种受survivin启动子调控的CD自杀基因的重组腺病毒的制备方法,包括以下步骤:

S1. 克隆survivin启动子:设计引物,通过PCR的方法从BEL-7402细胞的基因组中扩增survivin启动子片段,克隆到pGEM-T载体中构建成重组质粒pT-SP,并进行序列分析;

S2. 构建survivin启动子调控绿色荧光蛋白GFP的报告质粒:用限制性内切酶Ase I和Nhe I双切pT-SP和pEGFP-N1质粒,回收survivin启动子和pEGFP-N1质粒大片段进行连接,构建成重组质粒pSP-EGFP;

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