[发明专利]C基因型阿德福韦酯耐药HBV稳定复制表达细胞系

说明书

技术领域

本发明属于微生物动物细胞系领域，涉及一种乙型肝炎病毒（HBV）稳定复制表达细胞系，特别是所含病毒来源于我国患者C基因型HBV株，且其DNA聚合酶/逆转录酶（RT）区含有核苷酸类似物阿德福韦酯耐药突变位点的病毒稳定复制表达细胞系。

背景技术

建立HBV稳定复制细胞模型，具有完整的病毒生命周期并能长期持续分泌病毒颗粒，是进行体外抗HBV药物的标准化筛选以及研究抗病毒机制的必需工具。由于HBV基因组结构紧凑，不同的读码框架及调控序列高度重叠，需要构建携带大于一个完整3.2kb HBV基因组序列的重组载体才能在转染的细胞系里建立稳定的HBV复制状态，保证3.5kb前基因组RNA的有效转录。已有的研究证实从1.05拷贝至4.0拷贝质粒均可用于产生稳定复制细胞系。国内外学者经过不同的尝试，建立了数株HBV复制细胞系，如目前公认并广泛应用的整合了D基因型/ayw亚型野生HBV株的HepG2.2.15细胞【Sells MA，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84:1005-9】，可被四环素调控表达的HepAD38细胞【Ladner SK，et al.Antimicrob.Agents Chemother，1997，41:1715-20】以及Huh7.93细胞、HepG2.117细胞等【Sun DX，et al.J Hepatol，2006，45:636-45】。

HBV至少分为A～H等8种不同的基因型和若干基因亚型，不同基因型HBV的病毒学特点各异，影响疾病进展和临床转归，特别是抗HBV药物的敏感度有较大影响。而上述已建立的HBV复制细胞株所整合的HBV DNA是A基因型和D基因型HBV株，而中国患者流行的HBV株主要为C基因型及B基因型，尤其是中国北方地区84%的HBV感染患者为C基因型【Li X，et al.J Clin Microbiol，2010，48(12):4363-9】。因此，已有的HBV复制成熟细胞株不一定能适用于针对我国流行HBV的抗病毒药物的研究。

此外，随着抗HBV药物核苷和核苷酸类似物种类增加及在临床长期广泛应用，HBV耐药变异株逐渐出现并成为临床抗病毒治疗失败或疗效不佳的主要原因。最早上市的核苷类似物拉米夫定因很好的抗病毒疗效且价格便宜而广为临床应用，但该药耐药率较高(5年达70%)，而阿德福韦酯为第一个上市的核苷酸类似物，因能有效抑制LAM耐药病毒和野生病毒复制，而成为临床LAM耐药患者和初治患者的最常用抗病毒药物，然而长期应用仍有较高耐药率发生，原发阿德福韦酯耐药突变位点为rtA181V+rtN236T。

为满足耐药突变株的病毒学特性研究以及一些新研发的抗病毒药物的药效评价，耐药突变HBV稳定复制细胞株也相继在一些实验室建立。如Ladner等在1998年率先建立了拉米夫定耐药突变（rtM204V/I）稳定复制细胞株【Ladner SK，et al.Antimicrob Agents Chemother，1998，42:2128-31】，Seifer等通过人为定点突变野生D基因型病毒，产生8株不同含拉米夫定耐药突变（rtL180M+rtM204V/I）、阿德福韦酯耐药突变（rtN236T+rtA181V）、替诺福韦酯耐药突变（rtA194T）及替比夫定耐药突变（rtL80I/rtM204I）稳定复制细胞株【Seifer M，et al.Antiviral Research，2009，81:147-55】，分析评价药物的抗HBV活性。由于这些耐药突变株都是通过定点突变技术人为产生的，得到的仅为非自然存在的突变株，人为定点突变会修改病毒的某些自然遗传特征，难以完全反映患者血清直接分离耐药株的表型特征。

关于我国临床分离的C基因型阿德福韦酯耐药突变HBV稳定复制细胞系尚未见报道。如果能够从长期用阿德福韦酯治疗的中国乙肝患者血清分离克隆含有阿德福韦酯耐药突变位点的HBV基因序列，建立中国流行的C基因型阿德福韦酯耐药HBV稳定复制细胞模型，对于抗C基因型阿德福韦酯耐药HBV的防治和新药药效评价具有十分重要意义。

发明内容

本发明的目的是从来源于中国流行的C基因型HBV株中构建一种耐阿德福韦酯HBV稳定复制表达细胞系，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有阿德福韦酯耐药突变位点rtA181V+rtN236T。该阿德福韦酯耐药细胞系能用于各种核苷和核苷酸类似物的耐药表型分析，可为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。

本发明进行了如下工作：