[发明专利]一种以温度高效调控水相中酶促反应的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以温度高效调控水相中酶促反应的方法。

背景技术

随着工业及生物技术领域的发展以生物酶为催化剂的酶促反应越来越多的应用于工业及医药生产。酶促反应具有高效、专一、反应迅速等优点，同时由于生物酶活性的特殊要求酶促反应多发生在水相体系中。然而正是因为酶促反应迅速的特点，水相中的酶促反应很难控制其反应进程及速率，给研究酶促反应机理和大量酶促反应的工业投产带来了一定的困难和危险。

现有的酶促反应调控方法多为宏观上单一的反应条件控制如：温度、pH的调节，这些技术只能在宏观上微小的改变酶促反应的进程，并不能真正起到快速、有效控制反应进行或停止的作用。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题。相对于现有技术，本发明可以实现从微观上迅速、简便的控制酶促反应的进行或停止。本发明通过在固载酶的体系中添加智能高分子凝胶颗粒，在微观上利用智能高分子凝胶颗粒对于温度变化灵敏感应的收缩或膨胀来开放或关闭酶与反应体系间的传质作用，就等同于在酶促反应中安装了“温敏式开关”，实现了利用温度高效、灵敏的调控酶促反应速率的目的。

本发明第一步合成具有温度敏感效应的智能高分子凝胶PNIPAM，该种智能高分子凝胶的响应温度为32℃，在32℃以上智能高分子凝胶PNIPAM在水中处于紧缩状态，其结构塌缩；而在32℃以下智能高分子凝胶PNIPAM在水中处于舒展状态，其结构蓬松，并且以上收缩及舒张的行为是可逆的。智能高分子凝胶PNIPAM的合成方法参考文献《PEG致孔快速响应pH/温度双重敏感性PNIPAM/SA水凝胶的制备与性能》。

本发明第二步对PNIPAM凝胶冻干后研磨粉碎，其凝胶颗粒粒径在100-200微米间。将该凝胶颗粒添加于酶的固载体系中。

本发明第三步实现酶的固载。将海藻酸钠溶于水中同时添加一定量的酶和PNIPAM凝胶颗粒，混合均匀后将该悬浊液滴加与2％的氯化钙溶液中形成均匀固载有酶及智能高分子PNIPAM凝胶颗粒的钙化海藻酸钠凝胶小球(其中海藻酸钠及酶均购于北京百灵威科技有限公司)。将该固载体系冻干并适量添加于所需反应中。在该步骤中的优选条件为：

海藻酸钠与水的比例为：1∶180—1∶220；海藻酸钠与PNIPAM凝胶颗粒的比例为：1∶1—1∶1.5；海藻酸钠与酶的比例为：1∶0.2—1∶0.3；冻干时间：8—１2小时。

本发明第四步实现酶促反应的高效调控。将相应的固载有酶和PNIPAM凝胶颗粒的催化体系应用于催化酶促反应中如：酯水解酶催化酯水解反应或手性拆分反应等。以32℃为调控的分界温度分别在水相中试验酶促反应的反应速率。实验证明由于32℃以下PNIPAM凝胶颗粒在水中处于舒展状态，其结构蓬松，堵塞了酶的活性中心位点并使水相反应体系与酶的固载体系间的传质作用减弱，使得酶促反应速率大大降低从而抑制了酶促反应的进行。而另一方面，32℃以上PNIPAM凝胶颗粒在水中处于紧缩状态，其结构塌缩，酶的活性中心位点得以裸露并使水相反应体系与酶的固载体系间的传质作用增强，使得酶促反应速率大大提高从而促进了酶促反应的进行。

而本发明的这一调控行为是可循环的，以32℃为调控的分界温度，利用温度小幅度上下变化来控制水相中酶促反应速率，实现对反应的“开”、“关”式调控。

附图说明

附图1是本发明调控原理及方法的示意图。

注释：1-钙化海藻酸钠；2-智能高分子PNIPAM凝胶颗粒；3-紧缩状态下的智能高分子PNIPAM凝胶颗粒；4-酶；5-在水中温度高于32℃；6-在水中温度低于32℃

具体实施方式

第一步：PNIPAM的合成

将0.94g的NIPAM单体、0.06g的海藻酸钠和0.02g的交联剂NMBA溶于4ml去离子水中，加入0.02g的PEG1000于上述溶液中，搅拌均匀；然后，加入0.02g的引发剂APS、0.02g的促进剂TMEDA，密封烧杯，在室温下反应48h；取出凝胶并切成薄片用去离子水浸泡一周，定期换水以洗去PEG1000和未反应的单体。

第二步：制备PNIPAM凝胶颗粒

第一步制备完成后将凝胶冻干10h，取出后研磨成粉末粒径在100-200微米间。干燥避光处保存以备后用。

第三步：酶的固载